Studium enzymových biokonjugátů pomocí biosensorů

Bc. Kateřina Petrášová

Diplomová práce

Anotace:

Cílem této práce bylo prostudovat chování enzymového konjugátu POD-2,4-D pomocí biosensorů s imobilizovanou protilátkou proti 2,4-D. Znalosti získané tímto výzkumem je možné využít při zlepšování mnoha analytických metod využívajících enzymové značky, např. ELISA. V první fázi byla provedena určitá optimalizační měření, například optimalizace fotometrického stanovení POD, sledování chování volného enzymu v průtočném a injekčním systému a studium chování enzymu vázaného na piezoelektrický sensor. Hlavní náplní této práce bylo studium chování enzymového biokonugátu POD-2,4-D pomocí biosensorů v průtočném systému. Byly vytvořeny 4 typy sensorů, na kterých byly zkoumány piezoelektricky a opticky vazebné vlastnosti enzymového konjugátu POD-2,4-D. Dva sensory byly potaženy proteinem G a dva proteinem A. Pro každý protein byl vytvořen jeden sensor s afinitně a jeden s kovalentně vázanou protilátkou proti 2,4-D. Bylo potvrzeno, že s rostoucí koncentrací POD-2,4-D roste jeho vazba na povrch biosensoru a zároveň vzrůstá velikost absorbančních píků. U všech typů také docházelo k poklesu absorbance se zvyšující se dobou průtoku 50 mM fosfátového pufru, pH = 7,0 nejvíce u sensoru s proteinem A a afinitně vázanou protilátkou. Při tomto měření bylo také zjištěno, že enzymový konjugát byl pevněji vázán na sensorech s kovalentně vázanou protilátkou proti 2,4-D. Sensory byly schopny opakovaného použití po regeneraci 20 mM glycinem, pH = 2,0. Kompetitivním měřením se třemi koncentracemi volné kyseliny 2,4-dichlofenoxyoctové bylo prokázáno, že reakce probíhá na povrchu sensoru a že se peroxidasa nesorbuje v hadičkách. Biosensor však patrně poskytuje odezvy i na volnou 2,4-D. Sensory s kovalentně vázanou protilátkou lze s úspěchem využít pro další charakterizaci enzymových konjugátů stejně jako kombinovaný opticko piezoelektrický systém. V budoucnu by mohly být prověřeny možnosti spřažení piezoelektrického sensoru s jinou detekční metodou.

Abstract:

The aim of this work was to improve characterization of enzyme bioconjugate POD-2,4-D. There were four sensors created to measure binding properties of this conjugate. They were coated with protein A and G. The antibody was immobilized using affinity complex and covalently. It was measured with different concentrations of the conjugate and the effect of an extended washing flow of phosphate buffer was studied. It was found, that the more concentrated conjugate binds more to the sensitive surface of the sensor. The absorbance increased with higher concentration as well as the frequence. The longer flow of the buffer caused the deacrease of absorbance, i.e. washing out the losely bound portions of the conjugate. The sensors were efficiently regenerated using acid glycine buffer and were repeatedly used. The competitive measurements confirmed, that the interaction with bioconjugate occurred at the surface of the biosensor.

Klíčová slova

biosensor, protein A, protein G, 2, 4-D, opticko-piezoelektrický systém

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 4. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 24. 5. 2006
• Vedoucí: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie