Rusticyanin bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans

Bc. Simona Vytopilová

Diplomová práce

Rusticyanin from Acidithiobacillus ferrooxidans

Anotace:

Bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans je kosmopolitní acidofilní bakterie způsobující okyselení okolního prostření. Hojně je využívána v biohydrometalurgii, při získávání kovů z rud. Ve svém dýchacím řetězci obsahuje protein rusticyanin, který zprostředkovává přenos elektronů pocházejících z oxidace Fe2+ iontů. Diplomová práce se zabývala přípravou rekombinantního proteinu rusticyaninu. Gen pro rusticyanin byl nejprve amplifikován z DNA bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans. Následně byl amplifikovaný gen pro rusticyanin upraven pro ligaci do extracelulárního expresního vektoru pPIC9. Poté byl vektor pPIC9 obashující gen pro rusticyanin linearizován pomocí restriktasy SacI a transformován do kvasinky P.pastoris. Po transformaci byl vybrán klon s nejvyšší produkcí rusticyaninu s využitím SDS-PAGE. Tento vybraný klon byl následně použit pro fermentaci. Po produkci rusticyaninu ve fermentoru bylo médium zakoncertováno a přečištěno od solí a nízkomolekulárních látek. Posledním purifikačním krokem byla ionexová chromatografie na koloně Mono S HR 5/5. Rusticyanin s histidinovou kotvou byl připraven obdobným způsobem jako rusticyaninu bez histidinové kotvy, ovšem jako výchozí gen pro histag-rusticyanin byl použit již připravený vektor pPIC9 s genem pro rusticyanin. Výhodou rekombinantního rusticyaninu s histidinovou kotvou byla purifikace, kdy po dialýze byla provedena pouze afinitní chromatografie s imobilizovaným iontem niklu (Ni2+), která umožnila přípravu čistého proteinu. Závěrem lze tedy říci, že příprava rekombinantního proteinu rusticyaninu i rusticyaninu s histidinovou kotvou byla úspěšná. Získání proteinů umožní do budoucna porovnat vzájemné odlišnosti mezi oběma typy rusticyaninu, například vlivu histidinové kotvy na stabilitu proteinu při pH hodnotách nad 5,5. Dále bude možné oba dva proteiny využít pro různé způsoby imobilizace za účelem identifikace možných interakčních partnerů.

Abstract:

A. ferrooxidans is a chemolithoautotrophic acidophilic bacterium causing acidification of environment. It is often used for the industrial recovery of metals e.g. copper by bioleaching. This bacterium obtains energy by oxidizing ferrous iron or sulphur compounds. Rusticyanin is a blue copper periplasmatic protein capable of transferring electrons involved in respiratory chain. Diploma thesis is focused on the over-expression of recombinant protein rusticyanin. Firstly the gene for rusticyanin was amplified, prepared for a ligation and inserted into extracellular expression vector pPIC9. Consequently pPIC9 vector was linearized by SacI restriction endonuclease and transformed into P. pastoris. After transformation the clone with the highest production of rusticyanin was chosen using SDS-PAGE. Selected clone was used for production of rusticyanin in fermenter when expressed rusticyanin was purified by ion-exchange chromatography on Mono S HR 5/5 column. Rusticyanin with his-tag was prepared in the similar way like normal rusticyanin when for amplification the previously prepared vector pPIC9 with gene for rusticyanin was used. The advantage of rusticyanin with his-tag was purification when after dialysis only affinity chromatography with immobilized nickel ion (Ni2+) was done to obtained pure protein The successful expression of rusticyanin and his-tagged rusticyanin enable compare different behaviour of these proteins in future, e.g. effect of his-tag to protein stability in pH higher than 5,5. Further it could be possible to use both proteins in different immobilization methods with goal to identify the possible interaction partners.

Klíčová slova

rusticyanin, Acidithiobacillus ferrooxidans, Pichia pastoris, pPIC9 vektor, PCR, klonování, transformace, fermentace, IMAC, IEC

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 6. 6. 2011
• Vedoucí: doc. RNDr. Oldřich Janiczek, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie