Využití metody Western-blotting s imunodetekcí k identifikaci proteinů světlosběrných komplexů

Ondřej DLOUHÝ

Bachelor's thesis

Western-blotting and immunodetection used for identification of light-harvesting proteins

Abstract:

Práce je zaměřena na zavedení a optimalizaci metody Western-blotting s imunodetekcí proteinů (především Lhcb1 a Lhcb3) světlosběrných komplexů fotosystému II (LHCII). LHCII a další pigment-proteinové komplexy (PPC) tylakoidních membrán Arabidopsis a smrku ztepilého byly separovány pomocí bezbarvé nativní elektroforézy (CN-PAGE). Byl vytvořen experimentální postup pro chemiluminiscenční detekci přítomnosti Lhcb1 a Lhcb3 zahrnující přenos PPC z gelu na PVDF membránu (tzv. mokrou cestou), navázání primárních (anti-Lhcb1 v ředění 1:1000, anti-Lhcb3 při ředění 1:3000) i sekundárních protilátek (typu IgG konjugované s enzymem HRP; 1:20 000). Předložený postup je aplikovatelný pro kvalitativní detekci Lhcb1 a Lhcb3 u Arabidopsis, v případě smrku ztepilého byla detekce proteinů Lhcb1 tímto postupem úspěšná pouze částečně. Pro kvantitativní stanovení uvedených proteinů by bylo nutné optimalizovat podmínky přenosu nebo využít přenos a následnou imunodetekci po separaci proteinů pomocí denaturující elektroforézy v druhém rozměru.

Abstract:

This thesis is focused on optimization of Western-blotting method used for detection of proteins (especially Lhcb1 and Lhcb3) of light-harvesting complexes of photosystem II (LHCII). LHCII and other pigment-protein complexes (PPCs) of thylakoid membranes of Arabidopsis and spruce species have been separated by using clear native electrophoresis (CN-PAGE). An experimental procedure for chemiluminiscent detection of presence of Lhcb1 and Lhcb3 including transfer of PPCs from gel to a PVDF membrane (so called wet transfer), binding of primary (anti-Lhcb1 in 1:1000 dilution, anti-Lhcb3 in 1:3000 dilution) and secondary antibodies (IgG type conjugated to HRP enzyme in 1:20 000 dilution) has been formed. Propounded procedure is applicable for qualitative detection of Lhcb1 and Lhcb3 of Arabidopsis. For spruce the detection of Lhcb1 protein has been successful only partially. For quantitative determination of mentioned proteins an optimization of transfer conditions would be necessary or a transfer and consequent immunodetection after denaturating electrophoretic protein separation could be used.

Keywords

Nativní elektroforéza, LHCII, Western-blotting, anti-Lhcb1, anti-Lhcb3, sekundární protilátky IgG-HRP, imunodetekce, chemiluminiscence, Arabidopsis, smrk

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2016

Accessible from:: 25. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Irena Kurasová, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Applied Physics / Biophysics