Structure and dynamics of subunits determining specificity of bacterial RNA polymerase

Mgr. Milan Zachrdla, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

RNA polymeráza (RNAP) je klíčový enzym při syntéze RNA, která katalyzuje transkripci. Pro efektivní funkci je RNAP a její specificita regulována interakcemi s dalšími podjednotkami. V této práci jsme se zaměřili na podjednotky určující specificitu RNAP z Gram-positivní bakterie Bacillus subtilis. Delta podjednotka RNAP je unikátní protein vyskytující se pouze u Gram-pozitivních bakterií a je příkladem částečně nestrukturovaného proteinu, jehož strukturovaná N-koncová doména je spojena s nestrukturovanou vysoce negativně nabitou C-koncovou doménou. Metoda NMR nám umožnila studovat nestrukturovanou C-koncovou doménu s atomovým rozlišením. Hlavním cílem této práce bylo určit strukturu N-koncové domény (sigma1.1) transkripčního faktoru sigmaA a popsat dynamiku této domény. Sigma1.1 reguluje vazbu DNA transkripčním faktorem sigmaA, což je nezbytný krok pro iniciaci transkripce. Vyřešená struktura má stejnou terciární strukturu jako struktura sigma1.1 z Gram-negativní bakterie Escherichia coli, což naznačuje, že odlišné uspořádání struktury sigma1.1 z Gram-pozitivní bakterie Thermotoga maritima může být výsledkem vlivu specifického prostředí, zatímco u mezofilních bakterií je terciární struktura konzervována. Znalosti získané během studia delta podjednotky jsem následně využil při zkoumání dvou izoforem merozoitního povrchového proteinu 2, 3D7 a FC27. Porovnání dynamiky obou izoforem, 3D7 a FC27, s výsledky studie antigenicity odhalilo korelaci mezi antigenicitou a sníženou flexibilitou polypeptidového řetězce. Úvod shrnuje současné poznatky o studovaných proteinech. Dále je zde popsán protokol určování struktury a analýza vnitřních pohybů proteinu. V Metodách je detailně popsána modifikace protokolu pro výpočet struktury. Navíc je zde představen koncept neuniformního vzorkování a popsán postup zpracování neuniformně vzorkovaných dat. Několik programů pro rekonstrukci neuniformně vzorkovaných dat bylo testováno s cílem optimalizace současného postupu v naší laboratoři. Dále byla zavedena poloautomatická procedura pro zpracování a analýzu neuniformně vzorkovaných experimentů. První sekce Výsledků popisuje studii strukturní diverzity sigma1.1 domény. Struktura byla vyřešena s využitím standardních experimentálních dat (NOE a třívazebné skalární interakce) a potvrzena pomocí zbytkových dipolárních interakcí poskytujících nezávislou strukturní informaci. Vyřešená struktura osvětluje rozdíly mezi doposud známými strukturami sigma1.1 domény. Detailně jsme se také zabývali dynamikou sigma1.1 domény. Druhá část Výsledků shrnuje studii MSP2. Je zde popsáno rezonanční přiřazení izoformy 3D7. Vzhledem k četným překryvům signálů v NMR spektrech bylo zapotřebí využít pěti-dimenzionální spektra v kombinaci s neuniformním vzorkováním. Výsledky analýzy dynamiky obou izoforem, 3D7 a FC27, byly porovnány s výsledky studie antigenicity provedené našimi spolupracovníky.

Abstract:

RNA polymerase (RNAP) is a key enzyme in RNA synthesis catalyzing transcription. For efficient function the RNAP and its specificity has to be regulated via interactions with additional subunits. In this thesis, we focused on subunits determining specificity of RNAP from Gram-positive Bacillus subtilis. The delta subunit of RNAP is a unique protein, present only in Gram-positive bacteria. The delta subunit is an example of a partially unstructured protein. Its well structured N-terminal domain is linked with an unstructured highly negatively charged C-terminal domain. NMR enabled us to study the unstructured C-terminal domain with atomic resolution. The main focus of this thesis was determination of structure and dynamics of an N-terminal domain (sigma1.1) of sigmaA transcription factor. Sigma1.1 regulates the DNA binding of sigmaA, which is essential for the initiation of transcription. The determined structure had the same fold as sigma1.1 from Gram-negative Escherichia coli. Thus suggesting that the different structure of sigma1.1 from Gram-positive Thermotoga maritima might be a result of a distinct environment of T. maritima while the structure is conserved in mesophilic bacteria. The know-how gained during the study of the delta subunit was then used to study the two isoforms of merozoite surface protein 2 (MSP2), 3D7 and FC27. The dynamics of both isoforms, 3D7 and FC27, was compared with the results of antigenicity assay revealing a correlation between antigenicity and decreased flexibility of the polypeptide chain. Introduction summarizes current knowledge of the studied proteins. The structure determination protocol is described as well as the analysis of internal motions of proteins. A modification of the protocol for structure calculation is described in detail in Methods. In addition, non-uniform sampling (NUS) and the processing of non-uniformly sampled data is presented. Various programs for reconstruction of NUS data were tested in order to optimize the current procedure in our laboratory. Semi-automated procedure for processing and analysis of NUS experiments was introduced. The first section of Results describes the study of structural diversity of the sigma1.1 domain. Structure was solved using standard NMR restraints (NOE and three-bond scalar couplings) and confirmed by an independent orientational restraints, residual dipolar couplings. The solved structure shed more light on the structural differences of currently available structures of the sigma1.1 domain. The dynamics of the sigma1.1 domain was studied in detail. The second section of Results summarizes study of MSP2. Resonance assignment of 3D7 isoform of MSP2 is described. Five-dimensional spectra combined with NUS were applied in order to resolve the signal overlap due to high chemical shift degeneracy of 3D7. The results of analysis of dynamics are followed by comparison with antigenicity assay done by our collaborators.

Keywords

protein, NMR, protein structure, RNA polymerase, intrinsically disordered protein, sigma1.1, Bacillus subtilis, relaxation, transcription initiation factor, molecular modeling, struktura proteinu, RNA polymeráza, vnitřně neuspořádaný protein, relaxace, transkripční iniciační faktor, molekulové modelování

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 9. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 3. 11. 2017
• Supervisor: prof. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.
• Reader: prof. Robert Konrat, prof. Ing. Richard Hrabal, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry