Role modifikací DNA komplexy kovů v terapii rakoviny.

Mgr. Jitka PRACHAŘOVÁ

Doctoral thesis

Role of DNA modifications by metal complexes in cancer therapy

Abstract:

Platinové komplexy jako cisplatina a její analoga jsou velmi účinná chemoterapeutika používaná k léčbě rakovinových onemocnění. Protinádorové účinky těchto sloučenin kovů jsou spojeny s jejich vazbou na molekuly DNA. Tato vazba způsobuje strukturní změny DNA, které ovlivňují životnost nádorových buněk a v konečném důsledku mohou vést až k buněčné smrti. Nicméně použití těchto látek v klinické praxi je omezeno řadou vedlejších účinků a vývojem rezistence k těmto lékům při opakovaném podání. Tato omezení jsou impulzem pro syntézu a testování nových sloučenin na bázi cisplatiny a také jejího trans-izomeru transplatiny. Hlavní část této práce je zaměřena na studium mechanismu účinku protinádorových léčiv, která mohou být selektivně aktivována pouze v cílových buňkách. Tyto sloučeniny patří do skupiny tzv. proléčiv. Proléčiva jsou syntetizována jako neaktivní formy látek s protinádorovým účinkem a do formy aktivního cytostatika mohou být konvertována přímo v oblasti nádoru například vlivem světla. Proléčiva platiny v oxidačním stupni PtIV mohou být redukována světlem do oxidačního stavu PtII. Tato redukce PtIV komplexů je nezbytná pro aktivaci jejich protinádorového účinku. V této práci byly testovány vlastnosti nových fotoaktivovatelných diazido komplexů trans,trans,trans-[Pt(N3)2(OH)2(Py)2] (1; Py = pyridin); trans,trans,trans -[Pt(N3)2(OH)2(MA)(Py)] (2; MA = methylamin) a trans,trans,trans-[Pt(N3)2(OH)2(MA)(Tz)] (3; Tz = thiazol). Byla analyzována vazba těchto látek na DNA a konformační změny vyvolané v DNA in vitro (v nepřítomnosti buněk). Dále byl testován vliv DNA aduktů komplexu 1 na syntetickou aktivitu RNA polymerázy II. Cytotoxicita zkoumaných látek byla zjišťována pomocí MTT testu. Bylo zjištěno, že všechny testované sloučeniny jsou inertní ve tmě. Po ozáření UVA nebo viditelným světlem dochází k jejich konverzi do aktivního stavu a následně k vazbě na DNA. Dané komplexy se preferenčně váží na guaninové a cytosinové báze DNA, podobně jako transplatina. Způsobují však větší distorzi DNA šroubovice a vytvářejí více meziřetězcových můstků na DNA. Právě meziřetězcové můstky způsobují nejvážnější poškození DNA nádorových buněk. DNA adukty fotoaktivovaného komplexu 1 jsou schopny zastavovat RNA polymerázu II mnohem efektivněji než cisplatina. Aktivované komplexy vykazují cytotoxicitu v mnoha lidských nádorových buněčných liniích. Druhá část předkládané práce se zabývá studiem nových sloučenin obsahujících dvě platinová centra spojená uhlíkatým řetězcem různé délky ?[{trans-PtCl(dien)}2-?-(CH2)n]2+ (n = 7,10,12, dien = diethylentriamin). U těchto látek byly zkoumány jejich interakce s DNA, metabolická stabilita a cytotoxicita. Bylo zjištěno, že s rostoucí délkou řetězce spojujícího platinová centra se zvyšuje závažnost distorzí vyvolaných těmito komplexy na DNA. Cytotoxicita studovaných komplexů v buňkách lidského ovariálního karcinomu také stoupá s rostoucí délkou řetězce. Dále jsme zjistili, že tyto sloučeniny jsou méně náchylné k metabolickému rozkladu, než konvenční bifunkční dinukleární komplexy platiny s trans geometrií vazebných ligandů. Tato zvýšená stabilita by mohla pomoci ke zmírnění vedlejších účinků a zlepšení terapeutické účinnosti dinukleárních platinových cytostatik. Výsledky této práce mohou přispět k objasnění mechanismu působení léčiv na bázi platiny. Získané poznatky také poukazují na rozdílné cytotoxické působení nově syntetizovaných platinových komplexů a konvenční cisplatiny, což by v budoucnu mohlo pomoci eliminovat vedlejší účinky spojené s klasickou chemoterapií.

Abstract:

Platinum complexes such as cisplatin and its analogues are widely used as effective chemotherapeutic agents. The cytostatic action of these transition metal compounds is connected with their binding to the DNA molecule. This binding process causes structural changes in DNA that affect the life of the tumor cells and ultimately triggers cell death. However, the use of these drugs in clinical practice is limited by a number of side effects and by the acquired resistance. To overcome these limitations new metal compounds on the basis of cisplatin and also of its trans-isomer, transplatin, are synthesized and tested. The main part of this thesis deals with the study of the mechanism of action of anticancer drugs which can be activated selectively in target cancer cells. These compounds belong among prodrugs. Such prodrugs are synthesized as inactive forms of anticancer compounds and can be activated e.g. by light to cytotoxic species in and around a tumor. PtIV prodrugs can be reduced by light to the PtII oxidation state. This reduction is necessary for PtIV complexes to exert their anticancer activity. In the present work we tested the properties of new photoactivatable diazido complexes trans,trans,trans-[Pt(N3)2(OH)2(Py)2] (1; Py = pyridine); trans,trans,trans-[Pt(N3)2(OH)2(MA)(Py)] (2; MA = methylamine) and trans,trans,trans-[Pt(N3)2(OH)2(MA)(Tz)] (3; Tz = thiazole). The DNA binding mode of these drugs was analysed and the modifications induced in DNA in vitro (in cell free media) including conformational alterations of DNA were investigated. The processing of DNA modifications by RNA polymerase II for complex 1 was tested as well. The cytotoxicity of our complexes was evaluated by standard MTT assay. All of tested drugs are unreactive in the dark. After irradiation by UVA or visible light they become active and bind to DNA. These compounds bind to DNA preferentially at guanine and cytosine sites, similar to transplatin, but with larger unwinding angles and a higher percentage of interstrand crosslinks. Interstrand crosslinks cause the most serious DNA damage of cancer cells. Major DNA adducts of photoactivated compound 1 are able to stall RNA polymerase II more efficiently than cisplatin. Photoactivated complexes are toxic towards a number of human cell lines. The second part of this thesis has been concerned on the study of new longchain dinuclear PtII compounds ? [{trans-PtCl(dien)}2-?-(CH2)n]2+ (n = 7,10,12, dien = diethylenetriamine). The DNA binding alterations, metabolic stability and cytotoxicity of these complexes were investigated. DNA binding studies demonstrated that the growing length of the bridge promoted more distorting conformational alterations induced in DNA. Cytoxicity of these complexes in ovarian tumor cells increased with the growing length of the linker. It was found that our compounds were less susceptible to metabolic decomposition than conventional trans-oriented dinuclear bifunctional PtII complexes containing linker chains. This enhanced stability may contribute to reduce side effects and increase therapeutic efficacy of the dinuclear platinum drugs. The results of this work should provide new insights into mechanisms associated with the antitumor effects of platinum complexes. These findings may also help to explain the different cytotoxic effects of new metal complexes and conventional cisplatin and help to overcome the side effects like those associated with conventional chemotherapy.

Keywords

cisplatina, platinové komplexy, DNA adukty, fotodynamická terapie, fotoaktivovatelná léčiva, polynukleární komplexy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 10. 2013

Accessible from:: 30. 10. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 18. 12. 2013
• Supervisor: prof. RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Physics / Biophysics