Electrochemical methods for the monitoring of enzymatic reactions based on electroactivity of unmodified and modified DNA and on application of marker substrates

Mgr. Anna Jennerová, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Studium redoxních procesů organických (bio)molekul je efektivním nástrojem pro charakterizaci jejich struktury a zároveň má potenciál prohloubení našich znalostí o elektrochemických metodách. Tato práce představuje novou studii tří redox-aktivních chemických látek. První z těchto látek je Sudan I, aromatické azo-barvivo. V minulosti se používalo jako potravinářské barvivo, ale později se ukázalo být zdraví škodlivé. Charakterizace Sudanu I byla provedena na elektrodách z pyrolytického grafitu a borem-dopovaném diamantu. Je zde představen způsob, jak odlišit Sudan I od jeho hydroxy-derivátů pomocí elektrochemie. Hydroxy-deriváty Sudanu I vznikají v lidském těle po zpracování enzymy s cytochromem P450 v játrech pomocí oxidativních i reduktivních procesů. Azo skupina Sudanu I a všech jeho derivátů je redukována během katodického skenu a projevuje se výrazným píkem na -0.7 V. Hydroxy skupiny Sudanu I a jeho derivátů vykazují rozdíly v oxidačních potenciálech. To je způsobeno jejich rozdílnou pozicí na aromatickém jádru a přítomností dalších substituentů, což má vliv na elektronovou hustotu jejich elektroaktivního centra. Báze Z je nepřirozený DNA báze, která může být plně inkorporována do DNA oligonukleotidů a dále replikována a transkribována. Je předložen popis jejího elektrochemického chování a také způsob, jak odlišit oligonukleotid obsahující Bázi Z ve své sekvenci pomocí nitro skupiny ve struktuře Báze Z. DNA se projevuje jedinečnými signály, které byly použity pro studium neznačených produktů koncové reakce deoxynukleotidylové transferázy. Detekce pomocí elektrochemie se prokázala být využitelná pro monitoring této reakce. Experimenty na elektrodě z pyrolytického grafitu prokázaly mimořádně přesnou detekci délky koncových produktů, zatímco elektrochemie na visící rtuťové kapkové elektrodě přinesla informace o různých strukturách DNA vytvářející se na oligonukleotidech, jako je vlásenka nebo G-kvadruplex.

Abstract:

The study of the redox processes of organic (bio)molecules is an effective tool for their structural characterization with the potential for the development of electroanalytical methods. This thesis presents a novel study of three redox active compounds. The first of these compounds is Sudan I, an aromatic azo-dye, which was historically used to colour foodstuffs but has subsequently been found to be harmful to human health. Characterization of Sudan I was performed on pyrolytic graphite electrodes and boron-doped diamond electrodes. The results of this analysis suggest a way to use electrochemistry to identify Sudan I which could ultimately be employed to detect its presence in adulterated foodstuffs. Also presented is a way to differentiate it from the hydroxy derivates that would be present in a patient after oxidation by cytochrome P450 enzymes in the human liver. This analysis builds on previous knowledge of the electroactivity of Sudan I using both oxidative and reductive processes. The azo group of Sudan I and all of its derivates is reduced in the cathodic scan and shows a distinctive reductive peak at 0.7 V. The hydroxy group(s) of Sudan I and its derivates exhibit differences in their oxidation potentials, as the electron density of this electroactive centre is influenced by their position on the aromatic core and the presence of substituents. The second compound, Base Z, is an unnatural DNA base which can be fully incorporated into a DNA oligonucleotide as well as replicated and transcribed. It is possible that electrochemistry could be used to detect the incorporation of this base into DNA, whether for labelling or for creation of novel DNA structures or sequence information. In this thesis, a characterisation of the electrochemical behaviour of base Z is presented, including a method to differentiate an oligonucleotide with Base Z in its sequence using the nitro-group in its nucleotide structure. Finally, natural DNA has several intrinsic signals, which were used for a study of label-free detection of the products of the deoxynucleotidyl transferase tailing reactions. Electrochemical detection has proven to be useful for monitoring this reaction. Experiments on pyrolytic graphite electrodes offer remarkably precise detection of the length of tailing products, while electrochemistry on hanging mercury drop electrodes revealed information about the various DNA structures forming in these oligonucleotides, such as DNA hairpins and G-quadruplexes.

Keywords

Elektrochemie, Voltametrie, Sudan I, Nepřirozené báze DNA, Elektrochemie DNA, Terminální Deoxynukleotidylová Transferáza

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 8. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 9. 2024
• Vedoucí: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
• Oponent: doc. RNDr. Romana Sokolová, Ph.D., doc. RNDr. Jana Skopalová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Genomika a proteomika / Genomika a proteomika