Vliv poruchy interakčního rozhraní mezi Axinem a c-myc na in vivo stabilitu c-myc.

Bc. Pavlína Víšková

Diplomová práce

Impact of disturbance of interaction interface between Axin and c-myc on in vivo stability of c-myc.

Anotace:

c-Myc je proto-onkogen, často deregulovaný v mnoha druzích lidských rakovin. Je to transkripční faktor s vnitřně neuspořádanou strukturou, a proto je jeho využití jako terapeutického cíle velmi obtížné. Za normálních podmínek v buněčném prostředí je c-Myc degradován prostřednictvím c-Myc degradačního komplexu, na jehož formování se podílí scaffold protein Axin1. V některých buněčných liniích rakoviny prsu je formování tohoto komplexu narušeno, díky aberantnímu sestřihu pre-mRNA Axinu1, jehož důsledkem je chybějící exon 9. Zda-li je tímto narušena přímá vazba proteinu c-Myc k Axinu1, nebylo dosud přesvědčivě prokázáno. V této práci jsem mapovala vazebné rozhraní mezi proteiny c-Myc a Axin1 pomocí techniky peptidových knihoven a co-IP experimentů a validovala funkční význam vybraného vazebného epitopu pomocí in vivo c-Myc degradačních esejí. Mapováním pomocí peptidových knihoven se mi podařilo identifikovat 3 vazebná místa pro c-Myc na Axinu1, z nichž jedno spadá do oblasti exonu 9. Dále, Axin1 plné délky imunoprecipitoval s c-Myc, zatímco Axin1 s delecí tohoto konkrétního vazebného epitopu interakci neprokázal. Předběžné výsledky naznačují, že při potlačení exprese endogenního Axinu1 pomocí RNAi a jeho nahrazení mutantní variantou s chybějícím vazebným epitopem je zpomalena degradace proteinu c-Myc. Získaná data ukazují, že c-Myc se váže k Axinu1 prostřednictvím epitopu v oblasti kódované exonem 9 a tato interakce má funkční význam při degradaci proteinu c-Myc.

Abstract:

c-Myc is a proto-oncogene frequently deregulated in many human cancers. As a transcription factor lacking rigid structure, its targeting is rather challenging. In a normal cell environment, it is degraded via c-Myc degradation complex mediated by the scaffold protein Axin1. In some breast cancer cell lines, however, the formation of the degradation complex is impaired due to aberrant splicing of Axin1 pre-mRNA, resulting in the loss of exon 9. The assessment of whether it leads to the disruption of direct interaction between Axin1 and c-Myc remains elusive. In this work, I have characterized the binding interface between c-Myc and Axin1 by means of the peptide microarray technique and co-IP experiments and validated the functional importance of the selected binding epitope by in vivo c-Myc degradation assays. By using the peptide microarray approach, I have identified 3 binding epitopes for c-Myc on Axin1, one of which falls within the region of exon 9. Further, full-length Axin1 immunoprecipitated with c-Myc while Axin1 lacking this particular binding epitope did not. Preliminary results indicate that upon knock-down of endogenous Axin1 via RNAi and its substitution with the mutant variant of Axin1, lacking the selected binding epitope, the c-Myc degradation rate is slowed down. The data show that the c-Myc binding to Axin1 is mediated by the epitope present in the region of exon 9 and that this interaction has a functional significance for the c-Myc protein degradation.

Keywords

proto-onkogen c-Myc, Axin1, c-Myc degradační komplex, peptidové knihovny, protein-proteinové interakce, c-Myc proto-oncogene, c-Myc degradation complex, peptide microarrays, protein-protein interactions

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 6. 2017
• Vedoucí: doc. Mgr. Lukáš Trantírek, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie