Možnosti stanovení oxidativního poškození rostlin vystavených abiotickým stresovým faktorům

Markéta VRABELOVÁ

Bachelor's thesis

Determination of oxidative damage in plants exposed to abiotic stress factors

Anotácia:

Tato práce se v rámci své teoretické části zabývá vlivem abiotických stresových faktorů prostředí na produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) v rostlinách, mechanismy vzniku primárních ROS (tj. superoxidového anion radikálu, peroxidu vodíku a singletního kyslíku), subcelulární lokalizací hlavních zdrojů ROS a interakcí ROS s vybranými bio-makromolekulami (lipidy, proteiny, DNA). Významným oddílem teoretické části je i přehled metod používaných k detekci primárních ROS v rostlinném materiálu, a to zejména metod využívajících reagentů, které tvoří s ROS barevné nebo fluoreskující sloučeniny. Mimo to je zahrnut také stručný přehled antioxidačních ochranných systémů (nízkomolekulárních i enzymatických), jimiž rostliny omezují negativní dopady oxidativního stresu vyvolaného zvýšenou produkcí ROS. Cílem experimentální části bylo ověření aplikovatelnosti vybraných metodik ke stanovení primárních ROS v rostlinách Hordeum vulgare vystavených stresovým podmínkám. Detekce ROS v rámci experimentální části byla provedena pomocí nefluorescenčních reagentů, které po reakci s ROS vytvářejí barevné produkty. Hladiny superoxidového anion radikálu byly stanoveny metodou NBT (Nitro blue tetrazolium), zatímco koncentrace peroxidu vodíku metodami DAB (3,3-diaminobenzidin) a FOX ("Ferrous oxidation-xylenol orange"). Vzniklé produkty byly detekovány mikroskopicky (NBT, DAB), případně byl stanoven jejich obsah ve vzorku pomocí UV-VIS absorpčního spektrofotometru (FOX). Rostliny Hordeum vulgare v této práci byly vystaveny stresu vyvolanému UV-B zářením (30 min, 2 h, 3 h, 24 h, 48 h, 4 dny) nebo vysokou ozářeností fotosynteticky aktivním zářením (HI ? 2000 ?mol?m-2?s-1, 30 min, 2 h, 3 h, 5 h). Kontrolní rostliny byly kultivovány za normálních podmínek v laboratoři. Z výsledků vyplývá, že detekce ROS pomocí mikroskopických metod NBT a DAB je možná pouze v případě, jsou-li produkovány za přítomnosti činidla. Produkty reakce ROS s činidly byly lokalizovány zejména v chloroplastech. Větší akumulace ROS byla zaznamenána především v případě akutního HI stresu. Působení dlouhodobého UV-B záření na rostliny (24 h, 48 h, 4 dny) nevedlo k výraznému nárůstu koncentrací primárních ROS. Zvolené metody detekce ROS nebyly schopny kvantifikovat aktuální množství ROS v rostlinném materiálu po ukončení stresu, a to zřejmě v důsledku velmi rychlé detoxifikace ROS antioxidačními systémy. Tyto metody však umožňují získat informaci o celkovém množství ROS generovaných v průběhu stresu, a to za předpokladu, je-li v pletivech současně přítomno vybrané činidlo. Testované metody detekce ROS se projevily obecně jako ne příliš citlivé a obtížně reprodukovatelné, k jejich širší aplikaci v ekofyziologických experimentech je proto nutná další optimalizace.

Abstract:

The theoretical part of presented work deals with the effects of abiotic stress factors on the accumulation of reactive oxygen species (ROS) in plants, mechanisms of primary ROS production (superoxide anion radical, hydrogen peroxide, and singlet oxygen), subcellular localization of major ROS and the interaction of ROS with important bio-macromolecules (lipids, proteins, DNA). A major section of the theoretical part is the overview of methods used to detect primary ROS in plant material, especially methods using reagents that form coloured or fluorescent products with ROS. An overview of antioxidant defence system (non-enzymatic and enzymatic), by which plants reduce the negative effects of oxidative stress caused by increased ROS production is given. The aim of the experimental part was to assess the applicability of selected methods for the determination of primary ROS in Hordeum vulgare plants exposed to stress conditions. Detection of ROS in the experimental part was performed using non-fluorescent reagents, which upon reaction with ROS form colour products. Superoxide anion radical content were determined by NBT (Nitro blue tetrazolium), while hydrogen peroxide was determined by DAB (3,3-diaminobenzidine) and FOX (Ferrous oxidation-xylenol orange). The products were detected microscopically (NBT, DAB), or their concentrations in the sample was determined using a UV-VIS absorption spectrophotometer (FOX). Hordeum vulgare plants used as the model plant in this work were exposed to stress induced by UV-B radiation (30 min, 2 h, 3 h, 24 h, 2 days, 4 days) or high irradiance by photosynthetically active radiation (HI ? 2000 ?mol?m-2?s-1, 30 min, 2 h, 3 h, 5 h). Control plants were cultivated under standard laboratory conditions. The results show that the detection of ROS using the NBT and DAB microscopic methods is only possible if they are produced in the concurrent presence of reagents in leaf tissue. The products of the ROS reaction with NBT and DAB reagents were accumulated mainly in chloroplasts. Greater accumulation of ROS was observed especially in the case of acute HI stress. The effect of long-term UV-B radiation on plants (24 h, 2 days, 4 days) did not lead to a significant increase in ROS concentrations. ROS detection assays were not able to detect the actual amount of ROS in plant material after the interruption of stress, probably due to the very rapid ROS scavenging by antioxidant systems. On the other hand, these methods offered information about the total (cumulative) amounts of ROS generated during stress, however this requires the presence of ROS detecting reagents in the plant tissues at the same time. All tested methods of ROS detection have generally proved to be rather less sensitive and difficult to reproduce, therefore further optimization is necessary for their wider application in eco-physiological experiments.

Kľúčové slová

Reaktivní formy kyslíku, peroxid vodíku, superoxidový anion radikál, abiotický stres, antioxidační obranný systém, chloroplasty

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2020

Zverejniť od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 6. 2020
• Vedúci: Mgr. Jakub Nezval, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Bachelor programme / odbor:
Applied Physics / Biophysics