Genetická detekce achondroplazie u historického kosterního materiálu

Bc. Martin Rusinko

Master's thesis

Genetic detection of achondroplasia in historical skeletal material

Abstract:

Achondroplazie je dědičné onemocnění kostí postihující jedno z 20 až 30 tisíc živě narozených dětí. Jedná se o nejfrekventovanější geneticky podmíněný typ nízkého vzrůstu u lidí. Postižení se manifestuje neúměrně krátkými proximálními segmenty končetin spolu s typickým vzhledem hlavy a obličeje. 95% případů achondroplazie je způsobeno bodovou mutací p.Gly380Arg v genu FGFR3, který reguluje enchondrální osifikaci dlouhých kostí. Kostry jedinců s patologicky nízkým vzrůstem jsou obvykle zkoumány pomocí tradičních morfoskopických a antropometrických metod. Špatný stav dochovaného kosterního materiálu a přítomnost chemických inhibitorů často brání tomu, aby byly tyto vzorky geneticky testovány. Předkládaná diplomová práce poskytuje přehled dosavadních studií dokumentujících lidský nanismus a stručně charakterizuje symptomatologii achondroplazie u kosterních pozůstatků. V současné době neexistuje univerzální metoda pro genetickou diagnostiku achondroplazie u kosterních pozůstatků. Hlavním cílem této práce proto bylo zavedení laboratorního protokolu pro genetické stanovení alelické formy genu FGFR3 u kostí s podezřením na achondroplazii. Sangerovu sekvenování zkoumaného lokusu předcházelo požití několika metod extrakce a amplifikace DNA. Z extrakčních metod se ukázala jako nejúčinnější metoda využívající magnetických částic (PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction Kit). Cílový lokus byl úspěšně amplifikován pomocí PCR s využitím: Q5® High-Fidelity DNA polymerázy, KAPA2G Robust PCR kitu a KAPA2G Robust HotStart ReadyMix PCR kitu. Alelická forma genu FGFR3 byla stanovena u tří z pěti testovaných jedinců s nanismem. Neúspěch při testování dvou neurčených vzorků byl přičítán stavu vstupního materiálu a vysoké metodické náročnosti analýz starobylé DNA. U všech tří úspěšně analyzovaných jedinců bylo prokázáno, že nesou normální variantu genu, tudíž velmi pravděpodobně netrpěli achondroplazií. Přítomnost normální alely u analyzovaných vzorků zároveň vyvolává diskusi, která další onemocnění mohla vést k nízkému vzrůstu jedinců. V této práci zavedený protokol je vhodný pro budoucí genetické testování dalších kosterních pozůstatků z muzejních sbírek, které byly dosud zkoumány výhradně antropologickými metodami.

Abstract:

Achondroplasia is an inherited bone disorder that occurs in one in 20,000 to 30,000 live recent births. It is the most prevalent form of genetically determined human dwarfism. Affected people are characterized by disproportionately short proximal segments of limbs and distinctive craniofacial appearance. 95% of cases is caused by a point mutation p.Gly380Arg in the FGFR3 gene which regulates endochondral ossification of long bones. Pathologically short skeletons are normally studied by traditional morphoscopic and anthropometric methods. Low preservation status of ancient osteological material and present chemical inhibitors often prevent such samples from being confirmed genetically. The presented thesis provides an overview of studies concerning the human nanism and briefly characterizes the symptomatology of achondroplasia in skeletal remains. Since there is no universal method for genetic diagnosis of achondroplasia in skeletal remains, the major intention was to establish a laboratory protocol suitable for genetic determination of the FGFR3 form in suspected bones. More methods of the DNA extraction and amplification were adopted prior to Sanger sequencing of the critical locus. The extraction method with magnetic particles (PrepFiler® BTA Forensic DNA Extraction kit) proved to be efficient. A successful PCR amplification of the locus was achieved by utilization of Q5® High-Fidelity DNA Polymerase, KAPA2G Robust PCR Kit, and KAPA2G Robust HotStart ReadyMix PCR Kit. The present form of the FGFR3 gene was determined in three out of five tested individuals with manifested nanism. The fault in testing of two undetermined samples was attributed to challenging nature of the aDNA manipulation. All three successfully analysed skeletons suspected of having achondroplasia were confirmed to carry the wild-type allele, to be negative. The presence of wild-type allele in the analysed samples opens the discussion, what other health conditions could led to the specific phenotype. The established protocol can be used for genetic testing of further skeletal remains from museum collections, which were, up to now, studied solely by anthropological methods.

Keywords

starobylá DNA, aDNA, paleopatológia, achondroplázie, disproporcionální trpaslictví, nanismus, genetika, FGFR3, ancient DNA, paleopathology, achondroplasia, disproportionate dwarfism, nanism, genetics

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2019
• Supervisor: Mgr. et Mgr. Kristýna Brzobohatá, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Special Biology