Optimalizace SPE metody pro stanovení fytohormonů

Bc. Jan PAVLÍK

Master's thesis

Optimization of SPE method for phytohormone profiling

Abstract:

Fytohormony jsou látky s regulační aktivitou, které hrají důležitou roli při vývoji či růstu rostlin. Vyvinuli jsme metodu pro efektivní a rychlé souběžné stanovení více skupin fytohormonů. Předkládaná metoda byla optimalizována pro stanovení auxinů, cytokininů a kyseliny abscisové. Extrakcí do vhodného rozpouštědla a přečištěním pomocí extrakce na pevné fázi (SPE) využívající kombinaci směsných kolon Oasis MCX a MAX byly získány tři frakce látek, rozdělených na základě jejich acidobazických vlastností. Bazičtější cytokininy byly odděleny od kyselejších auxinů a kyseliny abscisové za současné eliminace interferujících nečistot. Byla testována návratnost jednotlivých analytů ovlivněná výběrem vhodného extrakčního činidla. Použití 80% methanolu bylo zvoleno jako kompromis mezi požadavky na typ extrakčního činidla a chemickými vlastnostmi různých analytů. Dále byl pro tandemové spojení SPE kolon ověřován vliv odpařování použitého rozpouštědla na ztrátu analytu a vliv matričního efektu. Vyvinutá metoda byla validována pomocí základních validačních ukazatelů (relativní návratnost, denní a mezidenní variabilita, přesnost a správnost metody) na třech koncentračních hladinách (0,1; 1 a 10 pmol) přidaných k rostlinnému extraktu. Použitelnost navrhované metody využívající tandemové SPE uspořádání pro izolaci vybraných fytohormonů byla ověřena aplikací vyvinutého postupu na biologickém materiálu Arabidopsis thaliana. Závěrečná analýza poskytla výsledky endogenní hladin auxinů, cytokininů a kyseliny abscisové u 14- a 21-denních rostlin různých ekotypů Arabidopsis (Br-0, Cvi-0, GOT-1, RRS-7 a Van-0). Podle naměřených parametrů a získaných výsledků lze usoudit, že SPE metoda popsaná v této práci může být dále rozšířena o další metabolity studovaných hormonů nebo aplikována na jiné rostlinné matrice. Samotné portfolio studovaných skupin fytohormonů lze rozšířit například o gibberelliny, jasmonáty či kyselinu salicylovou.

Abstract:

Plant hormones are substances with control activity and play an important role in plant development and growth. We have developed a multiple method for efficient and rapid determination of phytohormones. The present method was optimized for the determination of auxins, cytokinins and abscisic acid. Extraction in efficient solvent and purification using solid-phase extraction (SPE) combined Oasis MCX and MAX columns divided the samples on three fractions, based on their acid and base properties. The basic cytokinins were separated from acidic auxins and abscisic acid together with elimination of interfering impurities. A suitable extraction solvent as a major impact on the recovery of individual analytes was tested. The use of 80% methanol was chosen as a compromise between the requirements for type of extraction and chemical properties of various analytes. Moreover, the loss of analytes during evaporation step and the effect of plant matrix were elucidated for tandem SPE protocol. Basic validation parameters (relative recoveries, intra- and inter-day variabilities, method precision and accuracy) were calculated with phytohormone standards added in plant extract at three different concentrations (0.1, 1 and 10 pmol). The applicability of the proposed methods using tandem SPE protocol for the quantification of the phytohormones selected was verified by application of the procedure developed on biological material of Arabidopsis thaliana. The final analysis showed endogenous levels of auxins, cytokinins and abscisic acid at 14-day and 21-day old A. thaliana plants (ecotypes Br-0, Cvi-0, GOT-1, RRS-7, and Van-0). Finally, according to the parameters and results measured, the developed method for phytohormone extraction and purification seems to be suitable not only for their quantification in Arabidopsis but also for the measurement of hormonal levels in other plant materials. The whole SPE protocol can be further extended to other studied metabolites and hormonal groups such as gibberellins, jasmonates or salicylic acid.

Keywords

Arabidopsis thaliana, extrakce na tuhou fázi, SPE, HPLC, kolona C18, kolona MAX, kolona MCX, kyselina abscisová, auxiny, cytokininy, MS, fytohormony, extrakce, purifikace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2012

Accessible from:: 27. 4. 2012

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Ondřej Novák, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry