Strukturní a funkční charakterizace vybraných variant halogenalkandehalogenas

Bc. Klára Marková

Diplomová práce

Structural and functional characterization of selected haloalkane dehalogenase variants

Anotace:

Enzymy jsou biologické katalyzátory, které urychlují chemické reakce. Nacházejí velké uplatnění při různých biotechnologických aplikacích, ty jsou však omezeny schopností enzymu zůstat stabilní v drsných podmínkách, jako je extrémní pH, přítomnost organických rozpouštědel nebo vysoká teplota. K vylepšení teplotní stability se tak často požívají nástroje proteinového inženýrství. Halogenalkandehalogenasy katalyzují hydrolytickou konverzi halogenovaných alifatických uhlovodíků na odpovídající alkoholy, protony a halogenidové anionty a mají praktický potenciál v biokatalýze, biosensingu nebo biodegradaci toxických polutantů. V této práci je představena strukturní charakterizace nejstabilnější varianty halogenalkandehalogenasy DhaA (DhaA115), u které pouze 11 vnesených mutací způsobilo zvýšení teploty tání o 24 °C. Tyto mutace byly navrženy na základě výpočetní strategie FireProt, která se zaměřuje na predikci vysoce stabilních proteinů a usnadňuje tak experimentální práci. Krystalová struktura enzymu DhaA115 odhalila dimerizaci prostřednictvím mechanismu 3D domain swappingu. 3D domain swapping nebyl doposud pozorován pro žádnou přirozenou nebo zkonstruovanou halogenalkandehalogenasu. Nově vytvořené sekundární rozhraní v domain-swapped dimeru DhaA115 je tvořeno hydrofobními interakcemi, ke kterým významně přispívají tři vnesené mutace každého řetězce. Analýza kvarterní struktury DhaA115 pomocí analytické gelové permeační chromatografie ukázala, že se DhaA115 v roztoku vyskytuje hlavně jako monomer (75,7 %) s částí dimeru (20,3 %), tetrameru (3,3 %) a hexameru (0,4 %). Biochemická charakterizace odděleného monomeru a dimeru DhaA115 ukázala rozdíly v aktivitě obou forem enzymu. Dimer DhaA115 vykazoval za testovaných podmínek 3,5 - 8krát vyšší dehalogenázovou aktivitu vůči 5 vybraným substrátům než DhaA115 monomer. Experimenty zaměřené na teplotní stabilitu potvrdily, že nikoli dimerizace, ale vnesené mutace stojí za zvýšenou teplotní stabilitou enzymu DhaA115. Teplotně denaturační experimenty prokázaly disociaci DhaA115 domain-swapped dimeru na funkční monomer při teplotě o 20 ° C nižší, než při které denaturuje monomer, což naznačuje, že mezi oběma stavy enzymu existuje nízká energetická bariéra.

Abstract:

Enzymes are biological catalysts which speed up chemical reactions. They are increasingly used in various biotechnological applications that are, however, restricted by enzyme´s ability to stay stable at harsh conditions such as extreme pH, presence of organic solvents or high temperature. Protein engineering strategies are therefore often applied to improve thermal stability. Haloalkane dehalogenases catalyse hydrolytic conversion of halogenated aliphatic hydrocarbons to the corresponding alcohols, protons and halide anions and have practical potential to be used in biocatalysis, biosensing or biodegradation of toxic pollutants. Here, we report structural characterization of the most thermostable variant of haloalkane dehalogenase DhaA (DhaA115) which exhibited ΔTm ~ 24 °C upon introduction of 11 mutations. The mutations were designed based on computational strategy FireProt focusing on prediction of highly stable protein variants which minimizes experimental effort related to engineering process. Crystal structure of DhaA115 revealed dimerization through 3D domain swapping mechanism. 3D domain swapping has not been observed for any natural or engineered haloalkane dehalogenase so far. The newly created secondary interface is formed by hydrophobic interactions, to which three introduced mutations from each chain significantly contribute. Analysis by size-exclusion chromatography revealed that DhaA115 is in solution present mainly as monomer (75.7 %) with portion of dimer (20.3 %), tetramer (3.3 %) and hexamer (0.4 %). The biochemical characterization of the separated DhaA115 monomer and dimer revealed differences in activity of both forms of the enzyme. The DhaA115 dimer exhibited 3.5 - 8 times higher dehalogenase activity towards 5 selected substrates under the tested conditions compared to the DhaA115 monomer. Thermal unfolding experiments confirmed that not dimerization but introduced mutations are responsible for increased thermal stability of DhaA115. Based on these experiments, domain-swapped dimer dissociates at temperature which is 20 °C lower than the temperature of monomer unfolding suggesting low energy barrier between both states of the enzyme.

Keywords

enzymy, halogenalkandehalogenasy, teplotní stabilita, 3D domain swapping, enzymes, haloalkane dehalogenases, thermal stability

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 6. 2018
• Vedoucí: doc. Mgr. Radka Chaloupková, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Tomáš Klumpler, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Experimentální biologie / Speciální biologie