Analýza vybraných léčiv pro léčbu roztroušené sklerózy pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí

Patrik MATLAK

Master's thesis

Analysis of selected drugs for the treatment of multiple sclerosis by liquid chromatography with mass spectrometry detection

Abstract:

Tématem diplomové práce byla analýza vybraných léčiv pro léčbu roztroušené sklerózy pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí. Jednalo se o stanovení natalizumabu ze séra pomocí bottom-up přístupu. Ten v prvním kroku štěpil tento imunoglobulin pomocí trypsinu na krátké specifické peptidy, které byly následně separovány kapalinovou chromatografii a detekovány pomocí hmotnostní spektrometrie. Práce se zabývala také různými postupy úpravy vzorků séra, které zahrnovali: ultrafiltrace, ?SPE extrakce. Pro validaci byly nakonec vybrány 2 metody přípravy vzorku. První metoda zahrnovala využití redukčního činidla DTT k rozrušení disulfidických můstku stabilizující terciární a kvarterní strukturu proteinů a alkylačního činidla iodoacetamidu využívanou pro mapování peptidů. Druhá metoda využívala práci se sraženinou. Vzorky obou metod poté byly podrobeny digesci za pomocí enzymu trypsinu. Analýza probíhala na dvou hmotnostních instrumentech: ESI-qTOF MS (SYNAPT G2-Si, Waters) a ESI-QqQ MS (Xevo XS, Waters). Pro úspěšnou kvantifikaci bylo nezbytné nalezení specifické sekvence peptidů pomocí ESI-qTOF MS. Nalezeno bylo několik specifických sekvencí peptidů a pro kvantifikaci byly vybrány 3 (jedna sekvence se nacházela na těžkém řetězci a dvě na lehkém řetězci natalizumabu). Stanovení natalizumabu probíhalo na UPLC-MS/MS systému. Pro analýzu byla použita kolona Acquity UPLC BEH C18 (100x2,1 mm, 1,7 ?m) při teplotě 55 °C s gradientovou eluci, objemem nástřiku 5 ?l a dobou analýzy 30 a 20 minut. K ionizaci byl použit elektrosprej v pozitivním módu (ESI+) a k detekci byl využit MRM mód (multiple reaction monitoring). První metoda byla validována z hlediska opakovatelnosti s variačním koeficientem v rozmezí 1,7 až 8,0 % a výtěžnosti v rozmezí 98,14 - 120 %. Druhá metoda byla validována z hlediska opakovatelnosti a mezilehlé preciznosti s variačním koeficientem v rozmezí 1,14 až 11,35 % a výtěžnosti v rozmezí 94,10 - 116,19 %.

Abstract:

The topic of the diploma thesis was the analysis of selected drugs for the treatment of multiple sclerosis using liquid chromatography with mass spectometry detection. This proteomic techniques using a bottom-up approach for the determination of natalizumab from human serum. In the first step, it cleaved this immunoglobulin with trypsin into short specific peptides, which were subsequently separated by liquid chromatography and detected by mass spectrometry. The work also dealt with various procedures for the treatment of serum samples, which included: ultrafiltration, ?SPE extraction. Finally, 2 sample preparation methods were selected for validation of the method. The first method involved the use of the reducing agent DTT to disrupt disulfide bridges stabilizing the tertiary and quaternary structure of proteins and the alkylating agent iodoacetamide for peptide mapping. The second method used worked with a precipitate. Samples of both methods were then digested with the enzyme trypsin. The analysis was performed on two mass instruments: ESI-qTOF MS (SYNAPT G2-Si, Waters) and ESI-QqQ MS (Xevo XS, Waters). For successful quantification, it was necessary to find the specific sequence of the peptides of natalizumab by ESI-qTOF MS. Several specific peptide sequences were found and 3 were selected for quantification (one sequence was on the heavy chain and two on the light chain of natalizumab). For quantification of natalizumab was determined on a UPLC-MS / MS system. An Acquity UPLC BEH C18 column (100x2.1 mm, 1.7 ?m) at 55 ° C was used for analysis with a gradient elution, injection volume of 5 ?l and analysis times of 30 and 20 minutes. Electrospray in positive ionisation mode (ESI+) was used. For detection was used MRM mode (multiple reaction monitoring). The first method was validated in terms of repeatability with a coefficient of variation in the range of 1.7 to 8.0 % and a yield in the range of 98.14-120 %. The second method was validated in terms of repeatability and intermediate precision with a coefficient of variation in the range of 1.14 to 11.35% and a yield in the range of 94.10-116.19 %.

Keywords

natalizumab, sérum, protilátky, kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2021

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 10. 6. 2021
• Supervisor: Mgr. Pavel Šištík, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry of Solid Phase