Počítačové modelování enzymů

Mgr. Jan Brezovský, Ph.D.

Doctoral thesis

Computer Modeling of Enzymes

Abstract:

Tato disertační práce se zabývá aplikací metod molekulového modelování ke studiu enzymů. Jako modelový systém byly pro účely tohoto doktorského projektu vybrány enzymy z rodiny haloalkandehalogenas (HLDs) a to zejména z následujících dvou důvodů. Za prvé, HLDs mají široké spektrum praktického využití, a za druhé, pro tuto skupinu enzymů je k dispozici velké množství znalostí o vztahu mezi jejich strukturou a funkcí. Celá práce byla motivována objevem vysoké enantioselektivity HLD DbjA ke dvěma třídám substrátům - konkrétně k α-bromovaným esterům a β-bromovaným alkanům. Na rozdíl od DbjA, byla u dalších HLDs vysoká enantioselektivita pozorována pouze s některými α-bromovanými estery. Analýza molekulární podstaty enantioselektivity enzymu DbjA odhalila, že za enantioselektivitu DbjA se studovanými třídami substrátů jsou zodpovědné dva strukturně rozdílné mechanismy. Popsaný rozdíl v původu enantioselektivity enzymu DbjA navíc umožnil kontrolovat tuto vlastnosti mutagenezí a to zvlášť pro α-bromované estery a zvlášť pro β-bromované alkany. Abychom lépe porozuměli principům spjatými s enantioselektivitou enzymu DbjA, byly provedeny dvě navazující studie. První z nich byla zaměřena na porovnání hydratace a dynamiky v ústí tunelů enzymů DbjA a DhaA. Tato studie poukázala na výrazné rozdíly ve sledovaných parametrech u těchto HLDs. Druhá studie se zabývala transplantací aktivního místa a přístupového tunelu z enzymu DbjA do struktury enzymu DhaA. Účelem této operace bylo získání mutantní varianty enzymu DhaA (nazvanou DhaA12), která by, podobně jako enzym DbjA, vykazovala vysokou enantioselektivitu s β-bromovanými alkany. Mutant DhaA12 sice získal vysokou enantioselektivitu s α bromovanými estery, avšak nízká enantioselektivita s β-bromovanými alkany zůstala bez zjevného zlepšení, přestože krystalové struktury enzymů DbjA a DhaA12 vykazují vysokou podobnost jak v oblasti aktivních míst, tak v přístupových tunelech. Důležitým zjištěním byla skutečnost, že hydratace a dynamika v ústí tunelu mutantního enzymu DhaA12 je podobná spíše divokému typu enzymu DhaA než cílovému enzymu DbjA. Tato diskrepance naznačuje, že nejen struktura aktivního místa enzymu a jeho přístupových tunelů, ale také jejich hydratace a dynamika jsou dalšími důležitými faktory ovlivňujícími enantioselektivitu HLDs. Nezávislé porovnání substrátových specifit jednotlivých HLDs ukázalo, že enzymy s velmi podobnou strukturou aktivního místa a přístupových tunelů nepatří dle jejich specificit do stejné skupiny. Toto poznání opětovně poukazuje na existenci dalších prvků určujících selektivitu HLDs. V průběhu jednotlivých studií byly přístupové tunely označeny za jedny z důležitých prvků ovlivňujících selektivitu enzymů. Zaměřili jsme se proto na vyhledání a porovnání nástrojů umožňujících studium tunelů a kanálů v proteinech. Na základě porovnání byl připraven návod ulehčující výběr vhodného nástroje ke studiu biologických problémů spjatých se strukturou a funkcí tunelů.

Abstract:

This Thesis focuses on the molecular modeling of enzymes. For this Ph.D. project, haloalkane dehalogenases (HLDs) were selected as a model system mainly due to: (i) a wide range of their practical applications and (ii) the wide knowledge about their structure-function relationships, compiled within many experimental and theoretical studies of these enzymes. This Thesis was initiated by observation of high enantioselectivity of HLD DbjA for two classes of substrates: α-bromoesters and β-bromoalkanes; other HLDs possess high enantioselectivity only with some α-bromoesters. Therefore the molecular basis of DbjA enantioselectivity was analyzed and two different structural bases determining enantioselectivity of DbjA towards these two classes of substrates were identified. Moreover, the different origin of enantioselectivity of DbjA allows its modulation by mutagenesis separately for α-bromoesters and β-bromoalkanes. To better understand principles involved in the enantioselectivity of DbjA, two follow-up studies were conducted. In the first, the dynamics and hydration of tunnel mouth of DbjA and DhaA enzymes were compared revealing significant differences in these parameters. In the second study, the active site and the access tunnel from DbjA were transplanted into the scaffold of DhaA with the purpose of creating enantioselective mutant of DhaA (named DhaA12). The mutant DhaA12 acquired high enantioselectivity towards α-bromoesters, but enantioselectivity of β-bromoalkanes remained unchanged even though the comparison of crystal structures of DbjA and DhaA12 shows close similarity of both active sites and access tunnels. Interestingly, hydration and dynamics at the tunnel mouth of DhaA12 is more similar to that of the wild-type DhaA than of the target DbjA. This result suggests that aside of structure also the hydration and dynamics play an important role in enantioselectivity of HLDs. Additionally, comparison of HLDs accordingly to their substrate specificity showed that enzymes sharing high structural similarity in their active sites and access tunnels do not belong to the same substrate specificity group, supporting the proposal of existence of additional factors governing selectivity of these enzymes. Trough-out these studies, the access tunnels have been found to serve as one of the determinants of enzyme selectivity. Therefore, we compared software tools applicable for investigation of tunnel and channels in protein structures to provide a guide for choosing a proper software tool according to a biological problem.

Keywords

molekulové modelování, enzym, substrátová specifita, enantioselektivita, proteinové inženýrství, racionální design, halogenalkandehalogenasa, molecular modeling, enzyme, substrate specificity, enantioselectivity, protein engineering, rational design, haloalkane dehalogenase

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 9. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 29. 9. 2011
• Supervisor: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.
• Reader: RNDr. Petr Kulhánek, Ph.D., Mgr. Kamila Réblová, Ph.D., Mgr. Michal Kutý, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Environmental Chemistry