Zavedení metodiky pro detekci inhibitorů acetylcholinesterázové aktivity

Bc. Lenka Hořanská

Master's thesis

Abstract:

ABSTRAKT Acetylcholinesterasa (AChE) je enzym s místem působení na nervové synapsi, kde katalyzuje rozklad nervového přenašeče acetylcholinu. Pokud je enzym inhibován, dochází k poruchám přenosu nervového vzruchu. Na principu inhibice tohoto enzymu fungují některé bojové plyny, ale také léčiva a pesticidy. Zejména pesticidy jsou pak vnášeny ve velkém množství do prostředí, které kontaminují. Ve vodním prostředí lze najít i další inhibitory acetylcholinesterasy, kterými jsou v tomto případě sekundární metabolity cyanobakterií. V současné době jsou známy dva sinicové toxiny s výše popsaným mechanismem účinku, přírodní organofosfát anatoxin-a(S) a alkaloid nostocarboline. V rámci práce byly optimalizovány a následně zavedeny dvě metody na detekci anticholinesterasové aktivity pro laboratoře RECETOXu. Zatímco jedna metoda využívá spektrofotometrciké koncovky, ve druhém případě je stanovení prováděno pomoci amperometrického biosenzoru. Oba způsoby stanovení byly ověřeny řadou měření s chemickými látkami, které obsahují prokázané inhibitory AChE. Jednalo se o léčivo Syntostigmin s účinnou látkou neostigmin methylsulfát a insekticidní přípravek Sumithion Super s účinnou látkou fenitrothion. V obou případech byla zaznamenána koncentračně závislá inhibice AChE. Po porovnání hodnot LOEC lze označit citlivost metod pro obě měřené látky za podobnou. S využitím výše popsaných metod byl dále proveden screening přítomnosti látek s anticholinesterasovou aktivitou v biomase cyanobakterií. Celkem bylo testováno 14 extraktů. Jedenáct z nich bylo připraveno extrakcí přirozených biomas vodního květu z různých lokalit ČR a další 3 extrakty pocházely z laboratorních kultur sinic, potenciálně produkujících inhibitory AChE. Výsledky spektrofotometrického stanovení byly v tomto případě velmi variabilní, což je nejspíše důsledkem přítomnosti interferujících látek (např. pigmenty) v extraktech. Využití biosenzoru se ukázalo jako lépe opakovatelná metoda a na základě těchto výsledků byly vytipovány extrakty potenciálně obsahující inhibitory AChE.

Abstract:

ABSTRACT Acetylcholinesterase (AChE) is enzyme, which catalyzes degradation of neurotransmitter acetylcholine in neural synapses. In case of AChE inhibition a disturbance in nerve impulse transmission occurs. This mode of action is known by some nerve agents, as well as by medicaments and pesticides. Especially the pesticides contaminate environment in huge amounts. Other AChE inhibitors that can be found in freshwaters are products of secondary metabolism of cyanobacteria. At these days two cyanobacterial toxins causing AChE inhibition are known. It is a natural analog of organophosphorus compounds anatoxin-a(S) and alkaloid nostocarboline. In the framework of this diploma thesis two methods for detection of anticholinesterase activity were optimized and established in laboratories of RECETOX. The first one uses a spectrophotometrical endpoint, the second one uses the detection on amperometric biosensor. Both methods were proven by series of measurements on chemical agents containing AChE inhibitors. We used the medicament Syntostigmin containing the effective component neostigmine methylsulphate and the insecticide Sumithion Super with the effective component fenitrothion. In both cases the inhibition depending on concentration were detected. Comparison of the two methods via parameter LOEC showed similar sensitivity. Using the methods described above, 14 samples of cyanobacterial biomass were tested on the presence of compounds with anticholinesterase activity. The 11 samples have been prepared form natural cyanobacterial blooms from different localities in the Czech Republic, the other 3 extracts have been obtained from laboratory cultures of cyanobacteria, which are potential producers of AChE inhibitors. The results of spectrophotometric detection varied significantly. This is probably caused by the presence of interfering substances (e.g. pigments) in the extracts. Detection with biosensor appeared as the method easier to repeat and the extracts, potentially containing AChE inhibitors, were chosen based on results.

Keywords

Klíčová slova, acetylcholinesterasa, cyanobakteriální toxiny, inhibice, spektrofotometrické stanovení, biosenzor Key words, acetylcholinesterase, cyanobacterial toxins, inhibition, spectrophotometrical detection, biosenzor

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 5. 2006

Thesis defence

• Date of defence: 2. 6. 2006
• Supervisor: Doc.Ing. Blahoslav Maršálek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / General Biology