Protein–proteinové interakce významné při neurodegenerativních chorobách

Mgr. Petr Louša, Ph.D.

Doctoral thesis

Protein-protein interactions important in neurodegenerative diseases

Abstract:

Proteiny z rodiny 14-3-3 se vyskytují u všech eukaryotických organismů, kde regulují významnou část buněčných pochodů skrze interakce se stovkami vazebných partnerů, obvykle prostřednictvím fosforylovaných neuspořádaných regionů. Tato rodina zahrnuje v lidském organismu sedm isoforem, které interagují za tvorby homodimerů a heterodimerů, jež se vzájemně liší svou funkcí i specificitou. I přes klíčovou roli dimerizace pro proteiny 14-3-3, její biofyzikální parametry doposud nebyly v literatuře kvantifikovány. Dimer-monomerní rovnováha je navíc silně ovlivněna fosforylací serinu 58 (číslováno dle lidské zeta isoformy) na dimerním rozhraní. V této práci představujeme design a analýzu sady experimentů, umožňujících kvantitativní analýzu dimer-monomerní rovnováhy proteinů 14-3-3. Určili jsme hodnoty rychlostních a rovnovážných konstant, Gibbsovy volné energie, entropie a entalpie. Hlavním objektem zájmu byla lidská isoforma zeta a její varianta fosforylovaná na serinu 58, několik experimentů bylo provedeno s využitím isoformy sigma. Ukazujeme také, že popsané postupy je možné relativně snadno využít pro další isoformy 14-3-3, ale i jiné rodiny proteinů, tvořící dimery s vysokou afinitou. Téma protein-proteinových interakcí se objevuje i v dalších popsaných projektech. Tyrosin hydroxylasa je enzym, který katalyzuje první krok v syntéze dopaminu a adrenalinu. Interakce s proteiny 14-3-3 je zprostředkována pomocí regulační domény, která může být fosforylována na několika místech v neuspořádané části. Pomocí neuniformně vzorkované, časově rozlišené nukleární magnetické resonance jsme kvantitativně charakterizovali kinetiku této fosforylace. Rovněž jsme určovali vliv vazby fosforylované regulační domény na dimer-monomerní rovnováhu 14-3-3. V dalším projektu jsme využili data získaná z relaxačních NMR experimentů, provedených na regulační doméně, pro porovnání biomolekulárních silových polí využívaných v simulacích molekulární dynamiky.

Abstract:

The family of 14-3-3 proteins is present in all eukaryotic organisms. The 14-3-3 proteins serve as important regulatory hubs interacting with hundreds of protein partners typically through phosphorylated intrinsically disordered regions. The family consists of seven isoforms in humans that readily form homodimers and heterodimers differing in function and specificity. Although the dimerization is a crucial feature of 14-3-3 proteins, the biophysical properties of the dimerization were not described in quantitative manner previously. Moreover, the dimer-monomer equilibria of 14-3-3 proteins are significantly affected by phosphorylation of serine 58 (numbering according the human zeta isoform) located on the dimeric interface. This thesis presents the design and analysis of a set of assays providing quantitative characterization of the 14-3-3 dimer-monomer equilibrium, evaluating the values of rate constants, dissociation constants, and thermodynamic parameters including Gibbs free energy, enthalpy and entropy. The presented experiments were performed on the human zeta isoform, its S58-phosphorylated variant, and the sigma isoform. However, it is readily possible to extend the developed methods and analysis to other 14-3-3 isoforms and also to other protein families forming tight dimers. The theme of protein-protein interactions is further extended in the other projects covered in this thesis. The tyrosine hydroxylase is an enzyme catalysing the first step in a pathway leading to dopamine and adrenaline. It interacts with 14-3-3 proteins through its regulatory domain that gets phosphorylated at multiple sites located within the intrinsically disordered N-terminal region. Using non-uniformly sampled time-resolved nuclear magnetic resonance, we quantitatively described the phosphorylation kinetics. We studied the impact of phosphorylated regulatory domain on the 14-3-3 dimer-monomer equilibrium. The structural features of the regulatory domain characterized by NMR relaxation experiments were employed to benchmark force fields used in molecular dynamics simulations.

Keywords

protein, protein-proteinové interakce, 14-3-3, tyrosin hydroxylasa, dimerization, dimerizace, dimer, monomer, fluorescence, FRET, MST, NMR, kinetika, disociační konstanta, fosforylace, protein-protein interactions, tyrosine hydroxylase, kinetics, dissociation constant, phosphorylation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 9. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 20. 10. 2022
• Supervisor: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Reader: Diego M. Bustos, Ph.D., prof. Martin Hof, Dr. rer. nat., DSc., Barbara Hribar Lee, PhD

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Life Sciences / Life Sciences