Chování nukleových kyselin na površích elektrod: vliv struktury a chemické modifikace

Bc. Marcela Hrušková

Diplomová práce

Behavior of nucleic acids at electrode surfaces: effects of structure and chemical modification

Anotace:

Přestože jsou nukleové kyseliny elektrochemicky aktivní, což umožňuje jejich elektrochemickou analýzu bez jakéhokoli značení, pro zvýšení selektivity a citlivosti detekce se často a pro různé aplikace využívá značení DNA. Převážná většina metod běžně užívaných pro elektroaktivní značení DNA je založena na reverzibilních nebo ireverzibilních redoxních systémech, nicméně systémy, ve kterých se uplatňuje katalytické vylučování vodíku, obvykle umožňují výrazně citlivější detekci. Schopnost katalyzovat vylučování vodíku byla očekávána i u thiopyrimidinů, což jsou báze, kde byly některé atomy kyslíku nahrazeny atomem síry. Části jejich struktur tak jsou podobné struktuře nepřirozených bází obsahujících síru, u nichž byla nedávno schopnost katalyzovat vylučování vodíku ukázána. V této práci jsem se zabývala analýzou elektrochemického chování tří vybraných thiopyrimidinů (2-thiocytosinu, 2-thiothyminu a 4-thiothyminu) a možností jejich inkorporace do DNA pomocí metody primer extension (PEX). Analýza těchto thiopyrimidinů ve formě nukleosid trifosfátů pomocí cyklické voltametrie odhalila schopnost poskytovat katalytické píky vylučování vodíku u 2-thiocytosinu a 4-thiothyminu a schopnost tvorby komplexů se rtutí u 2-thiothyminu a 4-thiothyminu. Schopnost tvorby komplexů se rtutí byla studována i u monomerních složek DNA obsahujících thymin. Produkty PEX reakce s inkorporovanými thiopyrimidiny byly analyzovány pomocí denaturační polyakrylamidové gelové elektroforézy, cyklické voltametrie a diferenční pulzní voltametrie (DPV). Zatímco u 2-thiocytosinu byly zjištěny problémy s inkorporací do DNA, oba thiothyminy poskytly produkty o plné délce. Při analýze pomocí DPV byl u 2-thiocytosinu a 2-thiothyminu zjištěn posun potenciálu píku vylučování vodíku do méně negativních hodnot, což indikuje schopnost katalyzovat vylučování vodíku takto modifikovanou DNA. Pro detekci modifikace je dostačující i jedna modifikace v molekule DNA. Získané výsledky naznačují možnost využití těchto thiopyrimidinů jako specifických a citlivých katalytických značek DNA, ale také ukazují na komplexnost elektrochemického chování těchto molekul, kdy na pozorované vlastnosti má vliv jak pozice modifikace v rámci molekuly, tak tautomerní forma, ve které se daná molekula nachází.

Abstract:

Although nucleic acids are electrochemically active, which allows their electrochemical analysis without any labeling, DNA labeling is often used in various applications to increase the selectivity and sensitivity of detection. The vast majority of methods commonly used for electroactive labeling of DNA are based on reversible or irreversible redox systems, however, systems in which catalytic hydrogen evolution is applied usually allow significant increase in the sensitivity of detection. The ability to catalyze hydrogen evolution was also expected for thiopyrimidines, which are bases where some of the oxygen atoms have been replaced by a sulfur atom. Thus, parts of their structures are similar to those of unnatural sulfur-containing bases that have recently been shown to catalyze hydrogen evolution. In this work, I analyzed the electrochemical behavior of three selected thiopyrimidines (2-thiocytosine, 2-thiothymine and 4-thiothymine) and the possibility of their incorporation into DNA using primer extension (PEX) method. Cyclic voltammetry analysis of these thiopyrimidines in the form of nucleoside triphosphates revealed the ability to provide catalytic hydrogen evolution peaks for 2-thiocytosine and 4-thiothymine and the ability to form complexes with mercury for 2-thiothymine and 4-thiothymine. The ability to form complexes with mercury was also studied for monomeric components of DNA containing thymine. Products of the PEX reaction with incorporated thiopyrimidines were analyzed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, cyclic voltammetry, and differential pulse voltammetry (DPV). While 2-thiocytosine was found to be problematic in the sense of its incorporation into DNA, both thiothymines gave full-length products. When analyzed by DPV, a shift of the potential of the hydrogen evolution peak to less negative values was detected for 2-thiocytosine and 2-thiothymine, which indicates the ability to catalyze hydrogen evolution by such modified DNA. Even one modification in the DNA molecule is sufficient to detect the modification. The obtained results indicate the possibility of using these thiopyrimidines as specific and sensitive catalytic DNA labels, but also show the complexity of electrochemical behavior of these molecules, where the observed properties are influenced by both the position of the modification within the molecule and the tautomeric form in which the given molecule appears.

Klíčová slova

značení DNA, thiopyrimidiny, cyklická voltametrie, diferenční pulzní voltametrie, katalytické vylučování vodíku, DNA labeling, thiopyrimidines, cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry, catalytic hydrogen evolution

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 18. 5. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2023
• Vedoucí: Mgr. Monika Hermanová, Ph.D.
• Oponent: doc. Ing. Renáta Šelešovská, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Genomika a Proteomika