Analysis of Arabidopsis telomere-associated proteins in vivo

Mgr. Martina Dvořáčková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Telomera-asociované proteiny hrají důležitou roli v regulaci všech procesů spražených s telomerami. Arabidopsis SMH (Single Myb Histone) rodina proteinů obsahuje 5 členů AtTRB1-5. Tyto proteiny jsou považovány za potenciální homology lidských telomera-vazebných proteinů, a tak za kandidátní složky rostlinného telomerického komplexu, shelterinu. AtTRB proteiny obsahují jedinečnou strukturu, která je tvořena N-teminální Myb-like doménou zprostředkující vazbu na telomery; centrální H1/H5-like doménou a C-terminální coil-coiled doménou. Naše předchozí práce ukázaly, že Myb doména AtTRB proteinů specificky rozpoznává a váže telomerickou dsDNA in vitro, zatímco centrální H1/H5-like doména je důležitá pro proteinové interakce. Dvou hybridní systém a in vitro immunoprecipitace ukázaly, že AtTRB1 je schopen dimerizovat a také vytvářet směsné dimery s ostatními AtTRB proteiny – AtTRB2 a AtTRB3. Cílem předkládané dizertační práce bylo aplikovat in vivo techniky k analýze dynamiky proteinů přímo v živých tkáních, tedy in vivo. Pro účel exprese AtTRB proteinů in vivo byla využita technologie GFP a fúzních proteinů, v kombinaci s A.tumefaciens zprostředkovanou transformací rostlinného materiálu. Dále byly optimalizovány vybrané techniky fluorescenční a konfokální mikroskopie (FRAP, mikroskopie v čase) za účelem získání in vivo dat s vysokým rozlišením. FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) patří mezi vysoce efektivní a často používaný nástroj k analýze dynamiky proteinů a protein-DNA interakcí přímo v buňkách. FRAP technika využívá výhod lazeru přítomného v konfokálním mikroskopu jako silného zdroje bodového světla. Tento lazer vypálí veškerou fluorescenci v oblasti zájmu a následná obnova fluorescence pak odpovídá dynamice daného proteinu v buňce. Mikroskopie v čase navíc monitoruje pohyb molekul v reálném čase včetně změn v jejich distribuci. V této práci jsme ukázali, že SMH proteiny jsou lokalizovány v jádře a jadérku. Jaderná a jadérková lokalizace AtTRB proteinů byla potvrzena ve všech testovaných systémech. Detailní studie distribuce AtTRB1 během buněčného cyklu ukázaly, že AtTRB1 je re-lokalizován do cytoplazmy během mitózy a pouze malá část tohoto proteinu asociuje s chromatinem během buněčného dělení. Dynamika AtTRB1 proteinu byla dále analyzována pomocí FRAP. FRAP technika byla také využita k pozorování dynamiky AtTRB1 po působení inhibitorů transkripce a agens indukující DNA zlomy. FRAP data ukázala, že AtTRB1 je vysoce mobilní protein. AtTRB1-DNA asociace probíhá za neustálé výměny AtTRB1 na DNA substrátu, naznačující, že AtTRB1 je vysoce dynamickou součástí chromatinu. Dynamika AtTRB1 nebyla pozměněna vlivem inhibitorů transkripce nebo indukcí DNA zlomů. Analýza AtTRB proteinů nebyla doposud popsána v žádné jiné publikované práci a proto jsou tyto výsledky první svého druhu.

Abstract:

Telomere-associated proteins are involved in the regulation of processes occurring at telomeres. The Arabidopsis ds-DNA binding proteins of the SMH (Single Myb Histone) protein family with 5 members AtTRB1-5, are potential components of plant telomeric complex shelterin. AtTRB proteins contain a unique structure with a telomere-binding Myb domain at the N-terminus, a central H1/H5-like domain and a coil-coiled domain that is C-terminally located. In our previous work we have shown that AtTRBs specifically bind telomeric dsDNA in vitro through the Myb domain, while the central H1/H5-like domain participates in protein-protein interactions. Two Hybrid system and in vitro immunoprecipitation experiments revealed that AtTRB1 could form homodimers and interact with AtTRB2, AtTRB3 and AtPot1b. The aim of this thesis was to use the in vivo analysis as a tool to describe detailed protein dynamics in the cell. We used GFP protein fusion strategy in combination with A. tumefaciens mediated plant transformation to express AtTRB proteins in plant material. Fluorescence and confocal microscopy techniques (FRAP, time-lapse microscopy) were optimised to obtain high resolution in vivo data. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) is a very useful tool to study protein dynamics in the cell as well as DNA-protein binding properties. In FRAP, high laser power of the confocal microscope is used to bleach desired area in the cell and the speed of fluorescence come back serves as a measure of the protein turnover. The time lapse microscopy in addition provides a true image of molecular movements and makes it possible to monitor changes in protein distribution in the cell. Our data revealed that SHM proteins are mostly nuclear factors with strong nucleolar labelling. This localisation pattern was consistent in several tested systems. In addition, AtTRB1 localisation changes during the cycle and the protein is redistributed into the cytoplasm during the mitosis. We have further used FRAP to look at AtTRB1 dynamics, and to analyse changes in dynamic upon inhibiton of transcription or upon MMS treatment. AtTRB1 appears to be highly mobile protein as results from FRAP. The association of AtTRB1 to DNA involves rapid protein exchange suggesting that AtTRB1 is a dynamic chromatin component. Inhibition of transcription or induction of DNA breaks did not have any effect on the AtTRB1 mobility in the cell. This work thus provides the first data on in vivo distribution of AtTRB1 and its dynamics inside the cell.

Keywords

protein, GFP, telomere, Arabidopsis, microscopy

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 2. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 30. 4. 2010
• Supervisor: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Michal Kozubek, Ph.D., RNDr. David Honys, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology