Strukturní vlastnosti biologicky významných kvadruplexů

MUDr. Markéta Fialová, Ph.D.

Disertační práce

Structural properties of biologicaly important quadruplexes

Anotace:

Studovali jsme biologicky významné fragmenty nukleových kyselin, které díky své neobvyklé nukleotidové sekvenci mohou vytvářet kvadruplexová uspořádání. Studiem série vhodně vybraných oligonukleotidů jsme ukázali, že vrstvení guaninů, jak u paralelního G-kvadruplexu (dále jen kvadruplexu) dG4, tak i u duplexu d(C4G4) v B-DNA i A-DNA uspořádání je velmi podobné. Tato strukturní neměnnost mohla mít význam v evoluci přenosu genetické informace a v základních funkcích nukleových kyselin, jako je například zahájení transkripce, rekombinace a další. (Kypr and Fialova, 2001) Věnovali jsme se studiu konformačních vlastností aptameru, který se specificky váže k thrombinu a inhibuje tím jeho aktivitu. Literární data uvádějí, že thrombinový aptamer se skládá do kompaktního antiparalelního intramolekulárního kvadruplexu. Pozorovali jsme, že thrombinový aptamer tvoří antiparalelní kvadruplex již v roztoku s nízkou iontovou silou. Přítomnost draselných iontů nebo etanolu kvadruplex stabilizuje, naopak sodné ionty jeho stabilitu mírně snižují. Překvapující bylo zjištění, že thrombinový aptamer tvoří, na rozdíl od publikovaných dat, ve vodném roztoku kvadruplex bimolekulární. Porovnáním s podobnými fragmenty DNA jsme zjistili, že i malá změna sekvence přidáním nukleotidů na různá místa aptameru umožňuje vznik intramolekulárního kvadruplexu. (Fialova and Kypr, 2006) V roztoku s draselnými ionty jsme studovali sekundární strukturu sady fragmentů lidské telomerní DNA G3(TTAG3)n, kdy n = 1-16. Zjistili jsme, že tvorba a typy kvadruplexů těchto fragmentů, jejich termostabilita a enthalpie, závisí na počtu TTAG3 opakování: Fragment G3(TTAG3)3 tvoří stabilní a velmi kompaktní intramolekulární antiparalelní kvadruplex. Se zvyšujícím se počtem opakování (n) jsou kvadruplexy daných fragmentů překvapivě méně termostabilní a jejich migrace na elektroforéze se zpožďuje. Na základě nemonotónního poklesu entalpie s rostoucí délkou telomerní sekvence jsme navrhli, že dlouhá telomerní DNA má, podobně jako nuklezomy, podobu „korálků na niti“. Tyto skutečnosti mohou vysvětlit postupné zkracování telomer v průběhu stárnutí buněk (Vorlickova and Chladkova, 2005). Studovali jsme konformační vlastnosti pyrimidinového, cytosinem bohatého řetězce hlavního řídícího elementu NHE III1 onkogenu c-myc, konkrétně čtyř fragmentů DNA o délce x = 16, 22, 27 a 33 nukleotidů. Zjistili jsme, že všechny studované fragmenty tvoří v mírně kyselých hodnotách pH cytosinové interkalované kvadruplexy, nazývané i-kvadruplexy. 16-mer tvoří nejméně termostabilní bimolekulární i-kvadruplex. I-kvadruplexy ostatních fragmentů jsou intramolekulární. Nejstabilnější je 33-mer a jeho sekvence představuje nejpravděpodobnější místo vzniku i-kvadruplexu in vivo (Simonsson and Pribylova - Fialova, 2000). Fragment G4T4G4 telomerní sekvence Oxytricha nova tvoří známý košíčkový typ bimolekulárního antiparalelního kvadruplexu v přítomnosti sodných i draselných iontů. Srovnávali jsme vlastnosti tohoto kvadruplexu s kvadruplexem jeho RNA analogu (g4u4g4), nebo RNA/DNA hybridů (G4u4G4, g4T4g4) a rovněž hybridních analogů s vybranými deoxyriboguanosiny substituovanými za riboguanosiny. Ribonukleotidová u4 smyčka paralelní kvadruplex stabilizuje, naopak deoxyribonukleotidová smyčka T4 jej destabilizuje. Draselné ionty jednoznačně stabilizují paralelní bimolekulární uspořádání. Navíc fragment g4T4g4 tvoří dva typy bimolekulárních kvadruplexů, a to paralelní i antiparalelní (Vondruskova and Kypr, 2008a, 2008b).

Abstract:

We have studied biologically important fragments of nucleic acids that can form quadruplexes due to their unusual primary structure. Using a series of suitably selected oligonucleotides we have shown that the arrangements of guanines in the parallel G-quadruplex of dG4, and in the duplex of d(C4G4) in its both, B-DNA and A-DNA forms are very similar. This structural invariance might be important in evolution of genetic information and in the basic functions of nucleic acids, as e.g. in transcription. (Kypr and Fialova, 2001) We have studied conformational properties of an aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG), which specifically binds to thrombin and inhibits its activity. It has been shown in literature that the aptamer folds into a compact intramolecular anti-parallel quadruplex. We have, however, found that the aptamer forms a bimolecular quadruplex in an aqueous solution. The quadruplex is stable even in low salt solutions and it is stabilized by potassium ions or alcohol. In contrast, the presence of sodium ions destabilizes it. We have further shown that a slight change in the aptamer primary structure, e.g. an extension of the aptamer by a sequence containing further guanines, or an elongation of loop regions, causes the quadruplex to fold intramolecularly. (Fialova and Kypr, 2006) Human telomeric DNA is a further biologically important place capable of forming a quadruplex. We have investigated secondary structures of the G-rich strand of human telomere DNA fragments G3(TTAG3)n, where n = 1–16, in the presence of physiological concentrations of potasium cations. We have found that folding of these fragments into quadruplexes, their thermostabilities and their enthalpy values depend on the number of TTAG3 repeats: The quadruplex topologies include antiparallel and parallel bimolecular quadruplexes, an intramolecular antiparallel quadruplex, a quadruplex consisting of three parallel chains and one antiparallel chain, a poorly stable parallel intramolecular quadruplex, and both parallel and antiparallel tetramolecular quadruplexes. Fragment G3(TTAG3)3 forms a stable and a very compact intramolecular antiparallel quadruplex. With increasing number of repeats the quadruplexes surprisingly become less thermostable, and their migration velocity decreases. On the basis of non-monotoneous decrease of enthalpy values as a function of the telomere fragment length we have suggested that the long telomere DNA has, simar to nucleosomes, a “beads on a string-like” arrangement. These findings may explain gradual shortening of telomere DNA in the course of cell aging (Vorlickova and Chladkova, 2005). A major control element of the human c-myc oncogene is rich in cytosines in one strand and in guanines in another DNA strand, and exhibits multiple motifs for the formation of quadruplexes. We have searched for intercalated i-quadruplex formation of four c-rich fragments of 16, 22, 27 and 33 nucleotides in length. We have found that all the fragments formed i-quadruplexes at mild acidic pH values: The 16-mer formed the least stable bimolecular i-quadruplex, the other fragments formed intramolecular quadruplexes. The most stable structure was formed by the 33-mer. The sequence of the 33-mer corresponds to the most probable place of the i-quadruplex formation in vivo (Simonsson and Pribylova - Fialova, 2000). A fragment of the Oxytricha nova telomere DNA G4T4G4 is known to form an antiparallel quadruplex of the basket type in the presence of sodium or potassium ions. We have compared properties of this quadruplex with those of its RNA analog g4u4g4, or RNA/DNA hybrids G4u4G4 and g4T4g4, as well as with the hybrid analogs with selected deoxyriboguanosines substituted by riboguanosines. The ribonucleotide u4 loop stabilized the parallel quadruplex while, in contrast, the dT4 loop destabilized the RNA tetrads. Potassium ions markedly stabilized parallel quadruplexes of RNA-containing analogs as well as their bimolecular folding. In the presence of p

Abstract:

otassium ions, the g4T4g4 hybrid formed exclusively bimolecular quadruplexes of both parallel and antiparallel types. These findings may be useful for engineering particular quadruplex foldings in different quadruplex-forming sequences. (Vondruskova and Kypr, 2008a, 2008b).

Klíčová slova

Strukturní vlastnosti DNA, CD spektroskopie, telomera, aptamer, onkogen c-myc, konformace DNA Structural properties of DNA, CD spectroscopy, telomere, c-myc oncogene, DNA conformation

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 9. 2010
• Vedoucí: prof. RNDr. Michaela Vorlíčková, DrSc.
• Oponent: prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D., prof. RNDr. Vladimír Vetterl, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Fyzika (čtyřleté) / Biofyzika