Mechanizmy nemutační inaktivace proteinu p53 v lidských nádorech

Mgr. Martina Kučeríková, Ph.D.

Disertační práce

Mechanisms of p53 non-mutational inactivation in human cancer

Anotace:

Tumor supresorový protein p53 je klíčovým regulátorem buněčných stresových odpovědí a představuje jednu z nejčastěji narušených signálních drah v lidských nádorech. Přibližně polovina všech nádorů nese mutace v genu TP53, avšak řada malignit si zachovává nemutovaný (wild-type) gen, přestože vykazuje funkční útlum aktivity p53 prostřednictvím nemutačních mechanismů. Tyto procesy mají rozmanitou povahu a často unikají běžným diagnostickým metodám, což vytváří mezeru v porozumění tomu, jak je funkce p53 oslabena a jak tato skutečnost ovlivňuje léčebnou odpověď. Tato dizertační práce se zabývá molekulárními mechanismy nemutační inaktivace p53 a opírá se o dva na sobě nezávislé, avšak koncepčně propojené výzkumné cíle. V první části byla provedena celogenomová CRISPR–Cas9 aktivační (CRISPRa) screeningová studie v buňkách melanomu A375 ošetřených inhibitorem MDM2 (Nutlin-3a), jejímž cílem bylo identifikovat geny, jejichž transkripční aktivace ovlivňuje signalizaci závislou na p53. Screening odhalil několik kandidátních genů zapojených do drah regulace imunity, buněčného cyklu a zpracování RNA. Následné experimenty objasnily, jak tyto faktory vstupují do p53 signalizace a jak jejich účinek závisí na stavu p53. Výsledky první studie odhalily imunitně relevantní osu spojující stav p53 s expresí PD-L1 prostřednictvím transkripčních faktorů IRF1 a SOX10, což ukazuje, že ztráta p53 podporuje mechanizmy imunitního úniku. Další studie prokázala, že inhibice spliceosomální kinázy CDK11 ovlivňuje splicing cílového genu CDKN1A a vede k tvorbě cytoplazmatické izoformy p21. Tento jev ukazuje, že posttranskripční procesy mohou měnit kvalitu odpovědi p53 i v situacích, kdy je její aktivace zachována. Druhá část práce se zaměřuje na RNA-zprostředkovanou regulaci p53 a charakterizuje interakci mezi proteinem MDMX a mRNA genu TP53. Za použití rekombinantních proteinových konstruk¬tů, RNA-vazebných testů a hmotnostní spektrometrie (HDX-MS) byly zmapovány strukturní oblasti MDMX nezbytné pro vazbu na RNA a odhaleny konformační vlastnosti, které mohou usnadňovat stresově podmíněnou modulaci translace p53. Souhrnně tato zjištění ukazují, že aktivitu wild-type p53 může ovlivňovat více úrovní regulace, a to i bez přítomnosti mutací v TP53. Práce přináší nový mechanistický vhled do vztahu mezi signalizačními drahami a RNA-zprostředkovanou kontrolou exprese p53, čímž prohlubuje porozumění cestám vedoucím k nemutační inaktivaci tohoto klíčového tumor supresoru.

Abstract:

The tumour suppressor p53 is a central regulator of cellular stress responses and one of the most frequently disrupted pathways in human cancer. Although approximately half of all tumours harbour TP53 mutations, many malignancies retain a wild-type TP53 gene while exhibiting a functional suppression of p53 through non-mutational mechanisms. These mechanisms are diverse and often remain undetected by standard diagnostic approaches, creating a gap in clinical recognition of how wild-type p53 becomes attenuated and how this affects therapeutic responses. This dissertation investigates the molecular landscape of non-mutational p53 inactivation through two independent yet conceptually connected objectives. In the first part, a genome-wide CRISPR–Cas9 activation (CRISPRa) screen was performed in Nutlin-3a-treated A375 melanoma cells to identify genes whose transcriptional upregulation modulates p53-dependent signalling. This approach enabled the detection of regulatory factors that would remain hidden in mutation- or loss-of-function-based studies. The screen revealed several candidate genes associated with pathways related to immune signalling, cell-cycle regulation, and RNA processing. Follow-up analyses clarified how selected candidates integrate into the p53 pathway and how their regulation depends on p53 status. The first study identified an immune-related regulatory axis linking p53 status with PD-L1 expression through IRF1 and SOX10, showing that loss of p53 promotes immune-evasive signalling. The second study revealed that inhibition of the spliceosomal kinase CDK11 alters RNA splicing of the p53 target gene CDKN1A and induces a cytoplasmic p21 isoform, demonstrating that post-transcriptional regulation can qualitatively reshape p53 responses even when p53 activation remains intact. The second part examines the RNA-mediated regulation of p53, characterising the interaction between MDMX and TP53 mRNA using recombinant protein constructs, RNA–binding assays, and hydrogen–deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS). These experiments mapped the structural regions of MDMX required for RNA binding and revealed conformational features that may facilitate stress-responsive modulation of p53 translation. Together, these findings highlight distinct regulatory layers that can modulate wild-type p53 activity in the absence of TP53 mutation. The work provides mechanistic insight into both signalling-dependent mechanisms and RNA-mediated regulation of p53 expression, thereby refining understanding of the routes leading to non-mutational p53 inactivation.

Keywords

p53, nemutační inaktivace, MDMX, nádorové bunky, imunitní regulace, wild-type TP53, non-mutational inactivation, cancer cells, immune regulation

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 12. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 1. 2026
• Vedoucí: Mgr. Lucia Martinková, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Jakub Faktor, Ph.D., prof. Ing. Miroslav Strnad, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Genomika a proteomika / Genomika a proteomika