Strukturní charakterizace proteinů podílejících se na metabolismu R-smyček

Bc. Matyáš Láníček

Bachelor's thesis

Structural characterisation of proteins involved in the metabolism of R-loops

Abstract:

V průběhu transkripce se RNA polymeráza (RNAP) může zastavit, čímž se zvyšuje riziko kolize s replikací DNA, což může vyústit ve dvojvláknové zlomy na DNA a zvýšenou nestabilitu genomu. V této práci se zabýváme specifickými enzymy, které zprostředkovávají terminaci transkripce mediované RNA polymerázou II (RNAPII) a podílí se na metabolismu specifických RNA:DNA hybridů, tzv. R-smyček, čímž pomáhají řešit kolize transkripce s replikací DNA. Cílem této práce bylo připravit všechny potřebné materiály a prozkoumat molekulární mechanismus interakce jednoho z takových enzymů s R-smyčkou využitím metody analýzy jednotlivých částic (SPA) pomocí kryo-elektronové mikroskopie (cryo-EM). Iterativní optimalizací jsme eliminovali počáteční nedostatky v přípravě vzorku, čímž se nám podařilo získat kvalitní data pro SPA a rekonstruovat mapu ve výsledném globálním rozlišení 7.2 Å. Na základě poznatků z literatury jsme pak vytvořili model, který dobře koreloval s pozorovanými výsledky. V současnosti dále pokračujeme v optimalizaci procesu přípravy vzorku a zpracování dat s vidinou zlepšení stávajícího rozlišení. Výsledky této práce by mohly posloužit jako důležitý poznatek k porozumění mechanismům metabolizace R-smyček, čímž by v konečném důsledku mohly, vzhledem k asociaci metabolismu R-smyček s neurodegenerací, přispět do výzkumu léčby neurodegenerativních onemocnění, a tím tento výzkum posunout opět o malý krok dále.

Abstract:

During transcription, RNA polymerase (RNAP) may pause its progress increasing the risk of collision with DNA replication, which may result in double-strand DNA breaks and increased genome instability. In this work, I focus on specific factors, which terminate transcription mediated by RNA polymerase II (RNAPII) and participate in the metabolism of specific RNA:DNA hybrids, termed R-loops, to help resolve transcription-replication collisions. In this thesis, my aim was to prepare all the necessary materials and investigate the molecular mechanism of the interaction between one of these enzymes and an R-loop using single particle analysis (SPA) by cryogenic electron microscopy (cryo-EM). By an iterative optimization strategy, I eliminated the initial challenges in sample preparation and obtained high-quality data for SPA, from which I reconstructed a map with a final global resolution of 7.2 Å. Based on findings from literature, I then developed a model, which correlated well with the observed results. Currently, I am continuing the optimisation of the sample preparation and data analysis process in order to improve the current resolution. The results of this thesis could provide important insights into the mechanisms involved in R-loop metabolism, which, given the association of R-loop metabolism with neurodegeneration, could ultimately contribute to research of treatment for neurodegenerative diseases, thereby taking this research one step further.

Keywords

nestabilita genomu, RNA polymeráza II, R-smyčky, senataxin, neurodegenerace, Sen1, kryo-elektronová mikroskopie, Upf1, genome instability, RNA polymerase II, R-loops, neurodegeneration, cryogenic electron microscopy

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 17. 6. 2024
• Supervisor: Mgr. Marek Šebesta, Ph.D.
• Reader: PhD William Shakespeare Morton

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Physics / Biophysics