Analýza molekulárních a funkčních aspektů centriolárního cyklu

Mgr. Tereza Renzová, Ph.D.

Doctoral thesis

Analysis of molecular and functional aspects of cenriolar cycle

Abstract:

Centrioly jsou buněčné organely tvaru válce, složeného z radiálně uspořádaných mikrotubulů. V nedělících se buňkách zajišťují základnu pro tvorbu cilia, zatímco v proliferujících buňkách tvoří jádro centrozomu, jenž slouží jako struktura organizující mikrotubuly. Hlavní regulátory centriolární duplikace, kináza PLK4 a proteiny STIL a SAS-6, byly objeveny teprve nedávno. Centriolární abnormality byly v minulosti studovány především ve spojitosti s rakovinou, nicméně současné studie popsaly také význam mutací v regulátorech duplikace centriol pro vznik lidských vývojových poruch, jako jsou například ciliopatie, mikrocefalie a dwarfismus. Přesný mechanismus, jakým centriolární abnormality ovlivňují osud buněk během embryogeneze, však není zcela znám. Pro studium vlivu ztráty centriol na průběh časné embryogeneze jsme si jako model relevantní pro vývoj člověka vybrali lidské embryonální buňky (hESCs) a lidské indukované pluripotentní buňky (hiPSCs). K odstranění centrozomů jsme použili kombinaci biochemických a genetických přístupů, cílících na dříve zmíněné regulátory centriolární duplikace. Zjistili jsme, že centrozom jako takový není pro úspěšné rozdělení lidských pluripotentních buněk (hPSCs) potřeba, nicméně ztráta centriol vede ke zpomalení jejich proliferace, které je způsobeno prodloužením mitózy a interfáze. Monopolární a/nebo acentriolární mitózy vedou k akumulaci aneuploidních buněk, ale ne ke zvýšené apoptóze. Ztráta centriol u hPSCs vede k nárustu hladiny proteinu p53, v souladu s ostatními studiemi. Abychom tedy lépe popsali vztahy jevů vyvolaných ztrátou centrozomu, vytvořili jsme "p53 low" hPSCs linie. Vyvinuli jsme k tomu nový metodologický postup založený na opakované nukleofekci CRISPR/Cas9 plasmidu, s 82% úspěšností tvorby p53 knokautů. Dále jsme ukázali, že ztráta centrozomu vede ke ztrátě pluripotence, doprovázené indukcí diferenciace. Prokázali jsme, že k tomu, aby došlo k akumulaci p53 a diferenciaci buněk, je prodloužení mitózy dostačující. Také jsme dokázali, že pro diferenciaci buněk způsobenou ztrátou centrozomu je nutný p53. Oproti tomu snížení exprese markerů pluripotence po odstranění centrozomu je ale na p53 nezávislé. Ke ztrátě pluripotence přispívá deregulace proteinového metabolismu. Naše výsledky ukazují na nový vztah centrozomu, jeho regulátorů a udržení pluripotence nebo zahájení diferenciace hPSCs.

Abstract:

Centrioles are cellular organelles of barrel shape, which is given by the radial arrangement of microtubules. They account for cilia formation in quiescent cells, while in proliferating cells they form a core of centrosome, a microtubules-organizing structure. Recent years provided evidence that centriole assembly is tightly regulated by PLK4, STIL and SAS-6 as key players. Centriole abnormalities have been typically studied from the perspective of cancer. Additionally, recent reports have revealed connections between mutations of centriole duplication regulators and human developmental disorders such as ciliopathies, microcephaly and dwarfism. However, the exact mechanisms of centriole abnormalities influence cell fate during embryogenesis are not fully understood. To study the effect of centriole loss on early embryogenesis in a model relevant for human development we have chosen human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). To deplete centrosomes we have used a combination of biochemical and genetical approaches targeting the aforementioned regulators of centrosome duplication. We have shown that centrosome per se is not required for successful mitotic division in these cells, nevertheless, depletion of centrioles in human pluripotent stem cells (hPSCs) leads to slower proliferation due to prolonged mitosis and interphase. Monopolar and/or acentriolar mitoses lead to accumulation of various aneuploidies, but not to increased apoptosis. Consistent with other studies, loss of centrioles causes also increase of p53 protein levels. To further describe the relations of centrosome loss mediated effects, we generated "p53 low" hPSCs cell lines. We used a novel protocol of repeated nucleofections of CRISPR/Cas9 plasmid leading to 82% knock-out efficiency. We further showed that the loss of centrosome causes loss of pluripotency, and concomitantly leads to induction of differentiation. Our data identify that the prolonged mitotic timing is sufficient to trigger both the upregulation p53 and the differentiation. Moreover, we provided evidence that the differentiation triggered by centrosome depletion requires p53. Importantly, however, we have shown that the decrease in expression of pluripotency markers following centrosome loss is p53 independent. Finally, we pinpoint altered protein metabolism contributing to the observed loss of pluripotency after centrosome depletion. In sum, our data highlight a novel link between centrosome, its regulators and pluripotency maintenance or differentiation in hPSCs.

Keywords

centrozom, centriola, kmenová buňka, diferenciace, pluripotence, acentrozomální, elektroporace, CRISPR/Cas9, centrosome, centriole, stem cell, differentiation, pluripotency, acentrosomal, electroporation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 8. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 27. 9. 2019
• Supervisor: Mgr. Lukáš Čajánek, PhD.
• Reader: Mgr. Vladimír Rotrekl, Ph.D., Hisham Bazzi, PhD

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Anatomy, Histology and Embryology (4-years) / Anatomy, Histology and Embryology