Charakterizace protilátek vyvinutých pro detekci cytokininového receptoru AHK4

Bc. Hana Svozilová

Master's thesis

Characterization of antibodies developed for detection of cytokinin receptor AHK4

Abstract:

Cytokininy jsou fytohormony, které regulují rostlinný růst a vývoj. Genom Arabidopsis thaliana kóduje tři cytokinové receptory, ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 2 (AHK2), AHK3 a AHK4, jejichž subcelulární lokalizace je dodnes předmětem zájmu mnoha vědeckých pracovišť. Receptory jsou v buňce lokalizovány na plazmatické membráně a na membráně endoplazmatického retikula. Membránová topologie však není známá. Protilátky dostatečně citlivé a specifické rozpoznat jednotlivé receptory by byly cenným nástrojem pro studium jejich exprese, intracelulární lokalizace a funkční charakterizace. Cílem této diplomové práce bylo charakterizovat 4 polyklonální a 2 monoklonální protilátky vyvinuté pro imunodetekci AHK4 receptoru. Jako imunogeny byly použity purifikovaný protein C-terminální přijímačové domény AHK4 a syntetický peptid z extracelulární domény AHK4. Protilátky vyvinuté proti přijímačové doméně byly schopny in vitro detekovat 1 ng tohoto purifikovaného proteinu. V bakteriálních lyzátech polyklonální protilátky detekovaly specificky pouze AHK4 protein, zatímco monoklonální protilátky křížově reagovaly i s CKI1 proteinem. Křížová rekce s CKI1 proteinem se u všech protilátek ukázala také v extraktech z transgenních rostlin N. benthamiana, kde polyklonální protilátky detekovaly i AHK3 protein. Monoklonální protilátky však byly jediné, které byly specificky schopny rozeznat protein AHK4 v extraktech kořenů A. thaliana. Specifita protilátek byla testována v bakteriálním i rostlinném expresním systému metodou Westernového přenosu. Westernový přenos nebyl vhodný pro in vitro testování protilátek proti extracelulárnímu peptidu AHK4. Žádná z protilátek nebyla dostatečně citlivá k rozeznání endogenní exprese proteinu zájmu in situ. Výsledky také ukázaly, že přijímačová doména byla vhodnější imunogen pro získání protilátek než peptid z extracelulární domény.

Abstract:

Cytokinins are phytohormones that control many aspects of plant growth and development. Genome of Arabidopsis thaliana encodes three cytokinin receptors, ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 2 (AHK2), AHK3 and AHK4, whose subcellular localization is still being studied. Cytokinin receptors have been found to be localized to the endoplasmic reticulum as well as plasma membrane. However, the membrane topology remains unknown. Thus, antibodies specifically recognizing individual receptors would be valuable for studying their tissue and cell type-specific expression, the intracellular localization and characterization. The aim of this thesis was to characterize 4 polyclonal and 2 monoclonal antibodies developed for immunodetection of AHK4 receptor. The immunogens used for immunization were C-terminal receiver domain of AHK4 and synthetic peptide from extracellular domain of AHK4. Antibodies developed against receiver domain were able to detect 1 ng of this purified protein. Using crude bacterial lysates from Escherichia coli strain, the polyclonal antibodies were able to specifically distinguish AHK4, whereas monoclonal antibodies showed cross-reactivity with CKI1 protein. Cross-reactivity with CKI1 was also observed in extracts of transformed Nicotiana benthamiana leaves, where polyclonal antibodies cross-reacted with AHK3 as well. On the other hand, monoclonal antibodies had higher affinity and specificity for the AHK4 protein in extracts of Arabidopsis thaliana roots. The antibody specificity was tested both in bacterial and plant expression system by Western blotting. Western blot was found to be an unsuitable assay for in vitro testing of antibodies against AHK4 extracellular peptide. None of the antibodies was sensitive enough to detect endogenous expression levels of the protein of interest in situ. The results have shown the receiver domain was a more suitable immunogen for the antibody development compared to the extracellular peptide.

Keywords

CRE1, AHK4, WOL1, CYTOKININ RESPONSE 1, ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE 4, Arabidopsis thaliana, protilátky, imunodetekce, imunolokalizace, antibodies, immunodetection, immunolocalization

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 8. 6. 2017
• Supervisor: Ing. Blanka Pekárová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics