Využití metody FISH pro biologickou dozimetrii u pracovníků ve zdravotnictví v rizikových provozech a onkologických pacientů

Mgr. et Mgr. Dita Kadlčíková, Ph.D.

Doctoral thesis

Application of FISH for biodosimetry in healthcare workers in hazardous job operations and cancer patients

Abstract:

Zdravotníci mohou být při své práci vystaveni různým rizikovým faktorům a pro výzkum byli osloveni ti s rizikem expozice cytostatikům a/nebo ionizujícímu záření. Přestože radioterapie a chemoterapie zaznamenaly v posledních padesáti letech významné pokroky, zdravotníci mohou být při jejich přípravě a administraci ohroženi stochastickými účinky ionizujícího záření a cytotoxickým působením chemoterapeutik. Onkologičtí pacienti se s genotoxickými látkami setkávají při diagnostických výkonech, a hlavně během léčby samotné. Na celkovém poškození genetické informace pacientů se tak podílí nejen rozvíjející se maligní nádor a předchozí expozice škodlivým látkám, ale právě i diagnostické procedury a velmi zásadně protinádorová léčba. Poškození DNA zdravotníků, onkologických pacientů a kontrolních osob bylo detekováno fluorescenční in situ hybridizací s celochromozomovými malovacími sondami pro chromozomy 1, 2 a 4 a centromerickou sondou (WCP-FISH). Metodou WCP-FISH je možné odhalit stabilní chromozomové změny, které mají tendenci se při opakované nebo chronické expozici kumulovat v těle, např. translokace nebo inzerce, i nestabilní chromozomové aberace vypovídající o aktuální expozici genotoxickým látkám, např. dicentrické chromozomy, prsténčité chromozomy nebo acentrické fragmenty. Výsledky celého souboru zkoumaných osob byly použity pro ověření základních předpokladů a spolehlivosti metody WCP-FISH. Délka laboratorní kultivace zásadně ovlivňovala spektrum detekovaných chromozomových aberací. Při 72hodinové kultivaci jsme detekovali významný pokles dicentrických chromozomů a aberantních buněk. Ověřili jsme spolehlivost detekce chromozomových změn a přepočet chromozomových aberací matematickou extrapolací při vyšetřování WCP-FISH celogenomovou metodou mnohobarevné FISH. Odchylky od náhodného rozložení výměn na chromozomech byly detekovány na chromozomu 1. Nebyl však odhalen žádný mechanismus, který by byl jejich příčinou. Zdravotníci v rizikových provozech byli vyšetřováni dvakrát s odstupem 2 až 3 let. Porovnání odběrů odhalilo statisticky významný nárůst cytogenetických aberací vyšetřených konvenčním barvením Giemsou a nestabilních aberací detekovaných metodou WCP-FISH ve druhém odběru. Ve sledovaném období (2015 – 2018) nenastala na pracovištích zkoumaných osob žádná významná změna, avšak došlo k nárůstu objemu péče o onkologické pacienty. Obě metody zvýšení nestabilních aberací svědčící pro akutní expozici genotoxickým látkám spolehlivě detekovaly. Třetí část výzkumu byla věnována onkologickým pacientům před zahájením léčby. Zvýšená frekvence aberantních buněk byla nalezena u pacientů s nádorem trávicího traktu i u pacientek se zhoubným nádorem prsu. U pacientek bylo chromozomové poškození tvořeno stabilními aberacemi a buňkami s komplexními přestavbami. Pacienti s nádorem gastrointestinálního traktu měli zvýšenou frekvenci nestabilních aberací, která by však mohla být, částečně, vysvětlena expozicí ionizujícímu záření při diferenciální diagnostice. Naše práce potvrzuje výsledky předchozích studií, že zvýšená frekvence chromozomových aberací je prediktivním biomarkerem pro vznik a rozvoj rakovinného bujení. Poslední část dizertační práce se zaměřila na onkologické pacienty před a po plánované chemoterapii, radioterapii nebo konkomitantní chemoradioterapii. Všechny typy sledované léčby zvyšovaly hodnoty chromozomových aberací. U některých pacientů přetrvávalo chromozomové poškození i po třech letech od ukončení léčby. Pravděpodobně zásadní vliv na rozdíly v detekovaných četnostech chromozomových změn po léčbě měla terapie ionizujícím zářením. Strukturní chromozomové aber

Abstract:

ace by mohly u onkologických pacientů před a po terapii sloužit jako markery rozvoje choroby, citlivosti k léčbě i chromozomové nestability. Chromozomové aberace jsou široce uznávaným markerem expozice/časného biologického efektu genotoxických látek. Biologický monitoring zdravotníků v rizikových provozech je důležitý pro sledování a omezování jejich profesní expozice. Nárůst chromozomových změn u zdravých osob je prediktorem rizika vzniku a mortality rakoviny. Vyšší frekvence chromozomových aberací byla rovněž potvrzena u nově diagnostikovaných pacientů. Zvýšení chromozomových změn během a bezprostředně po léčbě je mnohdy očekávaným vedlejším účinkem léčby, avšak dlouhodobé přetrvávání by mohlo mít prognostický význam.

Abstract:

Health care professionals may be exposed to various risk factors in their work, and those at risk of exposure to antineoplastic drugs and/or ionizing radiation were approached for the research. Although radiotherapy and chemotherapy have made significant advances in the last fifty years, hospital professionals may be at risk of the ionizing radiation stochastic effects and antineoplastic drug cytotoxicity during the therapy preparation and administration. Cancer patients encounter genotoxic agents during diagnostic procedures and especially during the treatment itself. Thus, not only the developing malignant tumour and previous exposure to hazardous agents, but also the diagnostic procedures and, very fundamentally, the cancer treatment contribute to the overall damage of genetic information of the patients. The DNA damage in health care workers, cancer patients and controls were detected by fluorescence in situ hybridization with whole-chromosome painting probes for chromosomes 1, 2 and 4 and a pancentromeric probe (WCP-FISH). The WCP-FISH can detect both stable chromosomal aberrations that tend to accumulate in the body with repeated or chronic exposure, e.g., translocations or insertions, and unstable chromosomal aberrations indicative of current exposure to genotoxic agents, e.g., dicentric chromosomes, ring chromosomes or acentric fragments. The results of the entire cohort of subjects were used to verify the basic assumptions and reliability of WCP-FISH. The length of a culture of blood significantly influenced the spectrum of the detected chromosomal aberrations. A substantial decrease of a level of dicentric chromosomes and aberrant cells was observed after 72 hours of incubation. The reliability of the detection of chromosomal changes and the calculation of chromosomal aberrations by mathematical extrapolation using WCP-FISH was verified by multicolor FISH. The deviations from a random distribution of exchanges on chromosomes were discover on chromosome 1. However, a mechanism causing them was not found. Health care workers at risk were examined twice, 2 to 3 years apart. The comparison of the samplings revealed a statistically significant increase in cytogenetic aberrations examined by the classical chromosomal aberration analysis and unstable aberrations detected by WCP-FISH in the second sampling. There was no significant change in the workplaces of hospital professionals, but there was an increase in the volume of cancer care during study period (2015 – 2018). Both methods were able to detect an increase in unstable aberrations indicating acute exposition to genotoxic agents. The third part of the research was devoted to cancer patients before treatment. An increased frequency of aberrant cells was found in patients with gastrointestinal cancer and in patients with breast cancer. In breast cancer patients, chromosomal damage consisted of stable aberrations and cells with complex rearrangements. Gastrointestinal tract cancer patients had an increased frequency of unstable aberrations, but this could be explained, at least in part, by exposure to ionizing radiation during a differential diagnosis. Our work confirms the results of previous studies that an increased frequency of chromosomal aberrations is a reliable predictive biomarker for cancer initiation and development. The last part of dissertation thesis has focused on cancer patients before and after chemotherapy, radiotherapy or concomitant chemoradiotherapy. All types of the studied treatments increased the values of chromosomal aberrations. Chromosomal damage persisted in some patients for almost three years after treatment. The ionizing radiation therapy probably had a major influence on the differences in the detected chromosome aberration frequencies after treatment. Structural chromosome aberrations in cancer patients before and after therapy could serve as markers of disease development, sensitivity to treatment and chromosomal instability. Chromosom

Abstract:

al aberrations are a widely accepted marker of exposure to/early biological effect of genotoxic agents. Biological monitoring of health care workers in hazardous job operations is important to observe and limit their occupational exposure. An increase in chromosomal aberrations in healthy individuals is a predictor of cancer risk and mortality. The increment of chromosomal damage has been also confirmed in newly diagnosed patients. An increase in chromosomal aberrations during and immediately after treatment is often an expected side effect of treatment, but long-term persistence could be of prognostic importance.

Keywords

chromozomová aberace, cytogenetická analýza periferních lymfocytů, fluorescenční in situ hybridizace, profesní expozice, cytostatika, ionizující záření, nádory prsu, nádory trávícího traktu, nově diagnostikovaní pacienti, chemoterapie, radioterapie, chemoradioterapie, chromosomal aberration, classical chromosomal aberration analysis, fluorescence in situ hybridization, occupational exposure, antineoplastic drugs, ionizing radiation, breast cancer, gastrointestinal cancer, newly diagnosed cancer patient, chemotherapy, radiotherapy, chemoradiotherapy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 10. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 25. 11. 2022
• Supervisor: prof. MVDr. Jiří Rubeš, CSc.
• Reader: MUDr. Radim Šrám, DrSc., MUDr. Hana Lehocká, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Molecular and Cell Biology and Genetics / Molecular and Cell Biology and Genetics