Application of reporter gene system in ecotoxicology

RNDr. Zuzana Flegrová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Genotoxicky aktivní chemické látky mohou při styku s živočichy interagovat s jejich DNA a následně ji poškozovat. Pokud není primární poškození této interakce opraveno, tak tento proces může vést k následným dějům jako jsou mutageneze, indukce chromozomálních aberací, karcinogeneze, nebo až dokonce k buněčné smrti a k dalším jevům jejichž důsledkem je poškození genetického materiálu buněk. Proto je velký důraz věnován eliminaci expozice populace těmito genotoxickými látkami a eliminaci genotoxických rizik vůbec. Tohle všechno je důsledkem vzrůstajícího výskytu rakoviny v živočišné populaci a poškozením lidského genetického fondu. Je spousta testovacích systémů, které jsou schopny rozpoznat expresi genu. Reporterové geny jsou používány ke kvantifikaci exprese genu a k rychlému určení úspěšnosti genových transferových technik. Jedna z nejdůležitějších skupin testů genových expresí, zaměřená na detekci poškození DNA a genové exprese, je skupina testů na bakteriálních kmenech. Tyto bakteriální testy se dají definovat jako jednoduché testovací systémy, umožňující kvalitativní a kvantitativní stanovení genotoxického potenciálu. Tento process je výsledkem specifické interakce mezi testovanou látkou a geneticky modifikovaným prokaryotickým organismem. To vše za specifických přesně stanovených podmínek. První část této studie je zaměřena na srovnání tří velmi známých, běžně používaných SOS reportérových systémů: RecA testu, UmuC testu a SOS chromotestu. Hlavním cílem bylo stanovit citlivost těchto testů a jejich následnou aplikovatelnost ve skríningu environmentálního znečištění. K tomuto srovnání bylo použito jak standardních mutagenních látek, tak vzorků matric prostředí. Stručné shrnutí výsledků první části označuje UmuC test jako nejvýhodnější test pro testování genotoxicity. Toto tvrzení vychází z porovnání výsledků tohoto testu s RecA testem a SOS chromotestem a to jak v kvalitativním, tak v kvantitativním směru. Pro testovaný výběr vzorků prostředí a standardních mutagenních látek se UmuC test jeví být optimálním pro stanovení genotoxického potenciálu. Druhá část této studie se zabývá studiem jednoho z novějších reporterových genových systémů RecA testu genotoxicity. RecA je luminescenční SOS test genotoxicity. Cílem tohoto výzkumu bylo zjistit zda má tento test budoucí uplatnění ve skríingovém hodnocení genotoxického potenciálu a srovnání citlivosti RecA testu při použití různých kmenů bakterie Escherichia coli. Genotoxicita byla v tomto případě detekovanána pomocí emise luminescence. Pro hodnocení citlivosti byla vybrána skupina čistých chemických látek a skupina vzorků environmentálních matric. Nejvýhodnějším testovacím kmenem E. coli byl pro náš výběr čistých chemických látek a kontaminovaných vzorků prostředí kmen DPD2797, pomocí kterého bylo možno detekovat genotoxický potenciál při velmi nízkých koncentracích jednotlivých chemikálií. Tento kmen také jako jediný z testovaných kmenů stanovil genotoxický potenciál u environmentálního vzorku kontaminovaného látkami POPs. Obyvatelé městských center trpí dlouhotrvající expozici ovzduší znečištěného toxickými chemikáliemi, které primárně pochází ze spalovacích procesů paliv, různých průmyslových aktivit a z topení. Spousta těchto znečišťujících látek vykazuje genotoxický a karcinogenní potenciál a to je něco, co je důvodem týkajícím se podezření, že u obyvatel měst je vzrůstající riziko vzniku rakoviny. Epidemiologocké studie udávají, že znečištění městského ovzduší je příčinou akutních toxických efektů u exponované populace, již při koncentracích znečišťujících látek, které jsou považovány za akceptovatelné. Co s

Abstract:

e týká karcinogenních efektů, tak epidemiologická fakta jsou zcela jasně pozitivní v případech značného znečištění vzduší. Odhad lidské inhalační expozice mutagenním a genotoxickým látkám je tedy velmi nezbytným v návaznosti na hodnocení veřejného zdravotního rizika. Cílem třetí části této studie bylo vyhodnocení proveditelnosti genotoxického skríningu na vzorcích ovzduší. Ovzduší je znečišťováno množstvím různých organických látek včetně polykondenzovaných aromatických uhlovodíků a jejich derivátů, které jsou většinou vázány na povrch respirabilních prachových částic. Některé z těchto látek vykazují genotoxické a karcinogenní efekty. Znečištění vázáno na prachové částice je tvořeno velkým mnoožstvím komponent, zahrnujících kyseliny (nitro-sloučeniny a sulfáty), organické látky, kovy a půdní a prachové částice. Velikost částic předurčuje jejich potenciál být příčinami zdravotních problémů. Velikost částic v atmosféře je velmi rozmanitá a pohybuje se řádově od několika nanometrů až po desítky mikrometrů. Velikost, tvar a chemické vlastnosti (hygroskopita) předurčuje životní cyklus částic v atmosféře a stejně tak i místo depozice uvnitř respiračního traktu. Účinky na zdarví ultrajemných částic (Ultra Fine Particles, průměr <100 nm) jsou pravděpodobně velmi odlišné od těch které způsobují částice hrubší (>2.5 μm). Zatímco čerstvě emitované UFP, sestávající se sazí a organických látek, mohou být méně hygroskopické a mohou penetrovat hlouběji do plicních alveol, tak hrubé částice, sestávající se z minerálních látek a solí, mají tendenci se uzazovat ve vyšších vrstvách respiračního systému. UFP jsou částí frakce jemných částic (<2.5 μm), u kterých je podezření, že jsou důležitější z hlediska úmrtnosti. Z výsledků je patrné, že spojení techniky pasivního vzorkování ovzduší s následnou analýzou genotoxického potenciálu může nabízet velmi efektivní nástroj pro monitoring rozličných škál znečištění ovzduší a zároveň může být použit pro výkum expozice a stanovení zdravotních rizik u obyvatel, kteří jsou znečištěným ovzduším exponováni. Poslední část této studie je zaměřena na výzkum velikosti a množství distribuovaných částic v městském ovzduší. Cílem této části práce bylo získat výsledky o velikosti distribuovaných částic a množství jednotlivých velikostních frakcí s následným výzkumem genotoxického potenciálu pomocí bakteriálního reporterového genového systému a ke zjištění, která velikostní frakce čístic vykazuje nevyšší míru genotoxického potenciálu a proč. Tato analýza byla doplněna pomocí chemického a mineralogického stanovení jednotlivých velikostních frakcí. Analýza následující po genotoxickém stanovení měly sloužit k detailnějšímu prozkoumání a k porozumění proč a která frakce vykazuje vyšší genotoxický potenciál než frakce jiná nebo proč tato frakce nevykazuje genotoxický potenciál vůbec. Největší množství částic bylo nalezeno při analýze nejjemnějšího filtru, nejnižší pak u středních velikostí filtrů. Nejvyšší procento množství PAHs je spojeno s jemnou velikostní frakcí. Genotoxický potenciál ztaké koresponduje s množstvím PAHs vázaných na jednotlivé velikostní frakce.

Abstract:

The genotoxic chemicals interact with genetic material of organisms and damage it. If primary damage of this interaction is not repaired, this process could lead to the consequent processes like mutagenesis, induction of chromosomal aberrations, carcinogenesis, cell death etc. A huge tendency is focused on elimination the population exposure to genotoxic substances and genotoxic risks. It is due to increasing cancer incidence and a damage of human genetic fund. There are many assays to determine gene expression. Reporter genes are used to help quantify expression and to rapidly determine success of gene transfer techniques. One of the most important groups of the tests focused on DNA damage and gene expression are tests on bacterial strains. These bacterial tests could be defined as simple testing systems which enable a qualitative and quantitative evaluation of genotoxic potential. This process is a result of a specific interaction between a tested compound and a genetically modified prokaryotic organism under the specific conditions. First part of this study is focused on comparison of three well-known SOS reporter assays, RecA test, UmuC test and SOS chromotest. The main point of this was to indicate sensitivity of these tests and their further applicability in environmental pollution screening. This comparison was on the basis of comparison of both effects on standard mutagens and environmental samples. Summarizing of first part is that the UmuC test is the best for genotoxicity detection in comparison to RecA test and SOS chromotest also in qualitative and quantitative way. For our choice of environmental samples and chemical standards UmuC test was optimal test for genotoxicity detection. The second part of this study deals with sensitivity of one of the newest RecA luminescent SOS genotoxicity test. The aim of this research was to decide whether this test has future applications in the screening evaluation of genotoxic potential and to compare sensitivity of the RecA test with various strains of Escherichia coli. The genotoxicity was detected by monitoring of bioluminescent emission. For assessment of the sensitivity evaluation a group of chemicals and environmental samples were selected. The best strain for our group of selected chemical standards seems to be the strain DPD2797, because the genotoxicity could be detected at very low concentration levels of particular chemicals and there was detected genotoxic potential of soil sample which was contaminated with POPs. Residents of urban centers suffer prolonged exposure to ambient air polluted with toxic chemicals arising primarily from the combustion of fuels used for transport, industrial activities and heating. Many of these pollutants have genotoxic and carcinogenic potential, something that has given rise to concern that city inhabitants may be at an increased risk of cancer. Epidemiologic studies have established that urban air pollution causes acute toxic effects to exposed populations, even at levels within the range currently considered acceptable. As regards carcinogenic effects, the epidemiologic evidence is clearly positive in cases of high air pollution levels. Estimation of the human inhalation exposure to the mutagenic and genotoxic compounds in the air is imperative for the public health risk evaluation. Objectives of the third part of this study were to evaluate the feasibility of screening genotoxicity tests on the air samples. Ambient air is polluted by variety of organic compounds including polycyclic aromatic hydrocarbons and their derivatives which are mostly bound on the surface of respirable dust particles. Some of these components exhibit genotoxic and carcinogenic effects. Particle pollution is made up of a number of components, including acids (such as nitrates and sulfates), organic chemicals, metals, and soil or dust particles. The size of particles is directly linked to their potential for causing health problems. The size of particles in t

Abstract:

he atmosphere varies over four orders of magnitude, from a few nanometers to tens of micrometers. Size, shape and chemical properties (such as hygroscopicity) govern the lifetime of particles in the atmosphere and the site of deposition within the respiratory tract. Health effects of ultrafine particles (UFP, diameter <100 nm) are likely very different from those caused by coarse particles (>;2.5 μm). While freshly emitted UFP, consisting of soot and organic compounds, may be less hygroscopic and penetrate deep into lung alveols, coarse particles, consisting of soil mineral elements and salts, tend to deposit in the upper part of the respiratory system. UFP is part of the fine particle fraction (<2.5 μm), which is suspected to be more important for mortality. Results indicate that the integration of the passive air sampling technique with the genotoxicological analysis may provide an effective tool for the air monitoring on various scales and for the screening of the genotoxic potential of ambient air samples which can be used for exposure assessment as a part of human health risk assessment. The last part of this study is focused on investigation of size and number of distributed urban air particles. The aim of this part was to observe results about particles size distribution and amount of individual particle sizes followed up with genotoxic assessment using bacterial reporter gene system and to asses which particle size fraction has the most significant genotoxic effect and why. This analyse have to be followed with chemical, mineralogical and particule size assessment of individual fractions. Analyses which followed genotoxic assessment have been tasked for more detailed characterization of particular size fractions and for better understanding of genotoxic or nongenotoxic potential of individual particle size fractions. The highest mass of particulate material was collected on the finest filter, the lowest on the intermediate fractions. The highest percentage of total amount of PAHs was associated with the fine fraction. Genotoxic potential also corresponds to the amount of PAHs associated with the individual size fractions.

Keywords

Genotoxicity, SOS chromotest, UmuC test, air pollution, fractionation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 3. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 22. 4. 2009
• Supervisor: doc. RNDr. Pavel Čupr, Ph.D.
• Reader: prof. Ing. Jiří Matoušek, DrSc., Ing. Viktor Mejstřík, CSc., prof. MVDr. Zdeňka Svobodová, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry (4-years) / Environmental Chemistry