Detekce houbových chitináz v životním prostředí

Bc. Petra Pospěchová

Diplomová práce

Detection of fungal chitinases in the environment

Anotace:

Chitinázy jsou hydrolytické enzymy rozkládající chitin- dusíkatý biopolymer široce rozšířený v prostředí. Jsou syntetizovány velkým množstvím organismů, přičemž u většiny těchto organismů byla zaznamenána produkce více typů chitináz. Chitinázy plní rozmanité funkce, mají např. roli při morfogenezi, výživě, obraně, parazitismu nebo koloběhu prvků. Především houbové chitinázy dále nabízejí široké možnosti uplatnění v průmyslu. Jelikož obrovský rezervoár potenciálně využitelných enzymů představují nekultivovatelné mikroorganismy, dochází v posledních letech k rozvoji výzkumu chitináz s použitím molekulárně biologických metod. V této práci byla zkoumána diverzita genů kódujících chitinázy hub pomocí amplifikačních reakcí s použitím šesti párů degenerovaných primerů. Primery byly navrženy na základě dostupných aminokyselinových sekvencí houbových chitináz v databázi NCBI. U pěti párů primerů se podařilo nastavit reakční podmínky tak, že byly detekovány produkty předpokládané délky (ve dvou případech však byly doprovázeny řadou nespecifických bandů). Produkty jedné z těchto reakcí byly dále podrobeny nested PCR s cílem vytvořit fragmenty vhodné pro analýzu rozdílů v jejich nukleotidových sekvencích prostřednictvím DGGE. V rámci testovaných genů pro houbové chitinázy nebyly zjištěny žádné sekvenční variace. Identita PCR produktů by však měla být ověřena sekvenováním nebo hybridizací, což nebylo v rámci práce z finančních důvodů uskutečněno.

Abstract:

Chitinases are hydrolytic enzymes that degrade chitin- a widespread nitrogen containing biopolymer. They are produced by a large variety of organisms. Most of these organisms have been found to synthesize multiple chitinases. Chitinases perform diverse functions, e.g. during morphogenesis, nutrition, defence, parasitism and for carbon and nitrogen cycle. Chitinases and especially fungal chitinases also have a huge potential for industrial applications. Since the non cultivated microorganisms represent immense pool of potentially suitable enzymes, an extensive development of chitinases research using molecular technologies has been carried out in recent years. In this thesis, the genetic diversity of chitinases encoding genes was investigated through the use of six pairs of degenerate primers. The primers were designed based on the fungal chitinases amino acid sequences available in the NCBI database. PCR products of a supposed length were detected in the case of five of these primer pairs (but in the case of two of them, nonspecific bands were also observed). Subsequently, products of the one of these reactions were subjected to the nested PCR in order to make DNA fragments suitable for DGGE analysis. No sequence variations were found among tested genes. The identity of the products should be verified by the sequencing or hybridization procedures, however, it could not be realized due to financial constraints.

Klíčová slova

Chitin, chitinázy, chitinases, houbové chitinázy, fungal chitinases, degenerované primery, degenerate primers, PCR, Nested PCR, DGGE

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2011

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 6. 2011
• Vedoucí: doc. Ing. Martin Krsek, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Obecná biologie