Evoluční a genetická analýza genomů rodu Trifolium s využitím genomických a bioinformatických nástrojů

Mgr. Jan Ištvánek, Ph.D.

Doctoral thesis

Evolution and genetic analysis of Trifolium genomes by means of genomic and bioinformatic tools

Abstract:

Rod Trifolium patří mezi nejvýznamnější a nejpočetnější rody čeledi Fabaceae. V zemědělství se nejvíce uplatňují jetel luční a jetel plazivý jako pícniny, či se využívá jejich schopnosti fixace vzdušného dusíku pro obnovu úrodné půdy. Genetická analýza těchto druhů je však komplikována cizosprašností a často i polyploidním charakterem jejich genomů. Žádný z genomů jetele dosud nebyl osekvenován. Pro popis genomů rodu Trifolium byla vybrána kulturní odrůda jetele lučního (T. pratense) Tatra a jetel prostřední (T. medium). Genomy byly osekvenovány metodou Illumina, přičemž u jetele lučního bylo dosaženo pokrytí 58,8 x (haploidní velikost genomu x = 418 Mbp), u jetele prostředního 23 x (haploidní velikost genomu x = 3154 Mbp). Vzhledem ke zvolenému přístupu de novo byly otestovány a vybrány vhodné programy pro sestavení referenčních sekvencí. Byla použita kombinace programů Abyss (assembler) a Echo (oprava sekvenačních chyb). V rámci popisu nově osekvenovaných genomů byla charakterizována jejich repetitivní část, která tvoří celkem 45,14% genomu u jetele lučního a 46,74% u jetele prostředního. U obou jetelů byly předpovězeny geny kódující proteiny, které byly následně anotovány (47398 genů u jetele lučního a 40837 u jetele prostředního) a zařazeny do funkčních kategorií a metabolických drah. Byly popsány klíčové enzymy ve šlechtitelsky významných biosyntetických drahách jako je biosyntéza izoflavonoidů. Detailněji byly prozkoumány významné rodiny genů (transkripční faktory, geny resistence a leghemoglobiny) a srovnány s osekvenovanými leguminózami i ostatními druhy rostlin. K popisu fylogenetických vztahů a položení základů pro komparativní biologii byly identifikovány ortologní geny a homologní sekvence popisovaných genomů s ostatními osekvenovanými rostlinnými druhy. Byly identifikovány kandidátní DNA markery. U jetele lučního bylo v rámci celogenomové sekvence identifikováno celkem 79579 mikrosatelitních markerů a 3714 markerů v kódujících oblastech. U jetele prostředního bylo identifikováno celkem 105275 SSR markerů v celogenomové sekvenci a 2118 v kódujících oblastech. V kódujících sekvencích byly identifikovány i SNP markery (343027 u jetele lučního a 1173184 u jetele prostředního). Pokrytí druhově specifickými SNP markery, v průměru 1 SNP na 144,6 bp v kódující sekvenci jetele lučního a 1 SNP na 70,1 bp u jetele prostředního, umožňuje jejich široké využití v praktických oblastech šlechtění. Byly popsány i mezidruhové SNP markery (1 SNP na 112,4 bp) u jetele lučního a prostředního umožňující studium variability i existujících hybridů. Získané informace a data představují podstatný pokrok ve znalostech o genomech rodu Trifolium a prohlubují naše znalosti genomů legiminóz. Představují základ pro využití nových molekulárně biologických metod, včetně vysokokapacitních systémů, ve šlechtitelských programech zaměřených na jetel.

Abstract:

Genus Trifolium belongs among the most significant and largest genera in Fabaceae family. The most employed species in agronomy, red clover and white clover, are used as fodder plants or to regenerate fertile soil by air nitrogen fixation. However, outcrossing and polyploid nature of their genomes complicate their genetic analysis. To date, none of their genomes was sequenced. The cultivated variety of red clover (T. pratense) Tatra and wild species zigzag clover (T. medium) were chosen to describe genomes of Trifolium genus. Genomes were sequenced with Illumina technology and genome coverages of 58.8 x and 23 x were achieved for red clover (haploid genome size x = 418 Mbp) and zigzag clover (haploid genome size x = 3154 Mbp), respectively. Based on chosen de novo approach, the programs were tested for their suitability to assemble the reference sequences. Combination of Abyss (assembler) and Echo (error correction) was used. Repetitive content of the newly sequenced genomes was characterised, comprising 45.14% and 46.74% of red clover genome and zigzag clover genome, respectively. The protein coding genes were predicted in both genomes, annotated (47398 genes in red clover and 40837 in zigzag clover) and classified into functional categories and metabollic pathways. The key enzymes involved in significant breeding biosynthetic pathways, e.g. biosynthesis of isoflavonoids, were identified. Important gene families (transcription factors, resistance genes and leghemoglobins) were studied closely and compared with other sequenced plants, especially legumes. Ortohologous genes and homologous sequences to other sequenced plant species were described, setting the basics for comparative biology and phylogenetics. Candidate DNA markers were identified. In red clover, a total of 79579 and 3714 microsatellite markers were indentified in the whole genomic sequence and in coding sequences, respectively. In zigzag clover, a total of 105275 and 2118 SSR markers were identified in genomic and coding sequences, respectively. Also, the SNP markers were predicted in coding sequences (343027 in red clover and 1173184 in zigzag clover). The mean coverage of 1 SNP marker per 144.6 bp in red clover coding sequences and 1 SNP per 70.1 bp in zigzag clover enable a wide utilization of these species specific markers in practical breeding. Variability and hybrids of the two clover species can be also assessed based on identified interspecific SNP markers (1 SNP per 112.4 bp). Presented information and data represent significant progress in the knowledge of genomes of Trifolium genus and other legume genomes. They constitute a basis for the use of new methods of molecular biology, including high-throughput systems, in breeding programs of clovers.

Keywords

jetel luční, jetel prostřední, sekvenování de novo, anotace nově sekvenovaných genomů, druhově specifické i mezidruhové DNA markery, red clover, zigzag clover, de novo sequencing, annotation of newly seuquenced genomes, species-specific and interspecific DNA markers

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 4. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 24. 6. 2015
• Supervisor: doc. RNDr. Jana Řepková, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Eduard Kejnovský, CSc., RNDr. Jiří Macas, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / General and Molecular Genetics