Studium sekundárních struktur DNA pomocí moderních biofyzikálních metod

Bc. Marek Zelinka

Bachelor's thesis

Studies of DNA Secondary Structures Using Modern Biophysical Methods

Abstract:

Guaninový kvadruplex (G-kvadruplex) je jednou z nekanonických sekundárních struktur DNA, na kterou mohou být zacílena nová protinádorová léčiva. Z těchto důvodu by bylo vhodné vyvinout rychlou a spolehlivou metodu detekce G-kvadruplexů. Tato práce se zabývá studiem možnosti detekce G-kvadruplexu, intramolekulárního i intermolekulárního, vedle neuspořádané formy oligodeoxynukleotidu využitím kapilární zónové elektroforézy. CD spektroskopie byla použita jako referenční metoda. Pro intramolekulární G-kvadruplex byl použit oligodeoxynukleotid obsahující repetitivní sekvenci lidské telomery (HUT-T2, 5’-AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3’) a pro intermolekulární G-kvadruplex sekvenci 5’-TGGGT-3’ tvořící tetramolekulový G-kvadruplex. Intermolekulární G-kvadruplex bylo možné stanovit vedle jeho neuspořádané formy využitím nepokryté křemenné kapiláry a 25mM HEPES + 10mM fosfát lithný + 20mM KCl, pH 6,5 jako základní elektrolyt s limitem detekce 2 resp. 5 µM. Plochy signálů obou sekundárních struktur závisí na koncentraci K+ a poměru K+ a Li+ iontů v základním elektrolytu. Žádné testované podmínky neumožnily separaci intramolekulárního G-kvadruplexu od jeho neuspořádané formy. Tato práce přináší soupis testovaných podmínek a základní informace o elektroforetickém chování vybraných sekvencí oligonukleotidů ve vztahu k jejich sekundární struktuře pomocí kapilární zónové elektroforézy.

Abstract:

Guanine quadruplex (G-quadruplex) is one of the several non-canonical secondary structures of DNA. This structure can be also used as a therapeutic target in cancer treatment. For this and other reasons it would be great to develop a method for it’s successful quantification. The aim of this work is to verify possibilities of capillary zone electrophoresis to separate intramolecular and intermolecular G-quadruplex from single-stranded DNA. As reference method was used CD spectroscopy. As a sequence forming an intramolecular G-quadruplex was used oligodeoxynucleotide HUT-T2 (5‘-AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G-3‘) including repetitive sequence of human telomere and for intermolecular G-quadruplex was used 5‘-TGGGT-3‘ which forms into tetraplex. Intermolecular G-quadruplex it’s possible to separate from it’s ssDNA form using barefused silica capillary and 25mM HEPES + 10mM lithium phosphate + 20mM KCl, pH 6,5 as a background electrolyte. Limit of detection and quantification is 2µM and 5µM for mentioned conditions. Areas of signals of both structures detected by capillary electrophoresis depends on concentration of KCl in background electrolyte and on the ratio of concentrations between Li+ and K+ ions in electrolyte. None of tested conditions was useful for separation of intramolecular G-quadruplex from it’s single-stranded form. This work shows overview of tested conditions and fundamental informations about behavior of this secondary structure related to quantification by capillary electrophoresis.

Keywords

deoxyribonukleová kyselina, guaninový kvadruplex, kapilární elektroforéza, sekundární struktura, spektroskopie cirkulárního dichroismu

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 17. 6. 2022
• Supervisor: RNDr. Aleš Daňhel, Ph.D.
• Reader: RNDr. Tomáš Křížek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry