Computational and NMR characterization of intrinsically disordered protein regions

Mgr. Vojtěch Zapletal, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Zajímali jsme se o vnitřně neuspořádané proteiny (IDP), které nejsou schopny samostatně vytvořit stabilní terciární strukturu. Jsou důležité pro procesy jako určení vazebných partnerů, regulace transkripce a často jsou spojovány s neurodegenerativními chorobami. Většina IDP jsou ve skutečnosti vnitřně neuspořádané oblasti, které jsou napojeny na strukturované domény. Jak pro experimentální, tak i pro výpočetní metody je složité pracovat s takovými hybridními proteiny. Běžné experimentální metody pro studium IDP jsou jaderná magnetická resonance a rozptyl rentgenového záření pod malým úhlem. V této práci jsou výsledky získané různými postupy vhodnými pro hybridní proteiny. První projekt je o mikrotubuly vázajícím proteinu 2c (MAP2c), který reguluje strukturu a dynamiku mikrotubulů během vývoje neuronů a dalších buněk. MAP2c má 49 kDa a obsahuje několik strukturních a funkčních oblastí. Byla provedena kvantitativní strukturní analýza experimentálních dat. Bylo vytvořeno spoustu náhodných struktur MAP2c pomoci programu flexible-meccano. Poté bylo pomocí programu ASTEROIDS, využívajícího genetický algoritmus, vybráno několik struktur, které v průměru odpovídají experimentálním datům. Zjistili jsme, že méně pohyblivé aminokyseliny jsou zapojeny do nestálého kontaktu mezi N-koncem a mikrotubuly vázající oblastí, a že oblasti, které mají vyšší míru uspořádání často odpovídají oblastem se známou nebo teoretickou funkční skupinou. Naše výsledky tak poukazují na blízký vztah mezi biologickými vlastnostmi a strukturními vlastnostmi tohoto proteinu. V dalším projektu jsme porovnávali vhodnosti silových polí pro simulace molekulové dynamiky na třech proteinech, které se lišily v délce uspořádané a neuspořádané oblasti. Z vypočtených simulací se predikovaly různé experimentální parametry včetně NMR relaxačních rychlostí. Z výsledků porovnávání vyplynulo, že méně běžně využívané NMR relaxační vlastnosti jsou citlivé na volbu silového pole a hlavně použitý model vody. Navržený porovnávací postup je citlivější než doposud používané a dobře se hodí i pro porovnávání nově vyvinutých silových polí. Poslední projekt obsažen v této práci se zabýval použitím 3D-HNCO experimentů pro měření 15N longitudinálních relaxačních rychlostí páteře proteinů s využitím dvou magnetických polí. Tyto experimenty umožňují měřit přesně longitudinální rychlosti při nízkém poli s rozlišením a citlivostí běžnou pro vysoká pole. Experimenty byly naměřeny na flexibilním C-konci delta podjednotky z RNA polymerázy z Bacillus subtilis. Tento protein má velké množství opakujících se aminokyselin a rozložení 15N chemických posunů v úzkém rozmezí. Výsledky této práce jsou dále použity v analýze kombinující NMR relaxační rychlosti a simulace molekulové dynamiky.

Abstract:

Intrinsically disordered proteins (IDPs) characterized by polypeptide chains that fail to fold into stable and well defined tertiary structure in an isolated state have been under our interest. They play key roles in processes such as molecular recognition, regulation of transcription and they are related to neurodegenerative diseases. Most of IDPs are in fact intrinsically disordered regions that are tethered to ordered domains. It is difficult to cope with such hybrid systems for the experimental techniques and for computational methods. Typical experimental methods for study of IDPs are nuclear magnetic resonance and small angle X-ray scattering. In this thesis, results of different approaches applicable to investigation of hybrid proteins are presented. The first project is investigation of microtubule associated protein 2c (MAP2c) which regulates structure and dynamics (polymerization and degradation) of microtubules in developing neurons and other cells. MAP2c is a 49 kDa intrinsically disordered protein consisting of several structural and functional regions. Quantitative conformational analysis of NMR chemical shifts, small angle X-ray scattering, and paramagnetic relaxation enhancement was performed. Pools of possible chain conformations were generated by the program flexible-meccano. The ensemble of structures reproducing the experimental data was selected by the program ASTEROIDS which uses a genetic algorithm. We found out that the least flexible amino acids are involved in transient long-range contacts between the acidic N-terminal domain and the microtubule-binding domain and that more ordered regions correlate with the regions of known or proposed function. Our results thus indicate a close relation between biological functions and conformational behavior of this protein. In the next study, we compared performance of force fields in molecular dynamics simulations of three proteins differing in the content of ordered and disordered regions. The obtained molecular dynamics trajectories were used to predict measurable parameters, including chemical shifts, residual dipolar couplings, paramagnetic relaxation enhancement, and NMR relaxation data. The results showed that the NMR relaxation parameters, rarely used for benchmarking, are particularly sensitive to the choice of force-field parameters, especially those defining the water model. The proposed benchmarking protocol is more sensitive to imperfections than the commonly used tests and well suited to evaluate the performance of newly developed force fields. The last project presented in this thesis was application of a 3D-HNCO-based two-field NMR experiment to measurements of protein backbone 15N amide longitudinal relaxation rates. The experiment provides accurate longitudinal relaxation rates at low field (0.33 T) preserving the resolution and sensitivity typical for high-field NMR spectroscopy. The experiment was demonstrated on the flexible C-terminal domain of the delta subunit of RNA polymerase from Bacillus subtilis, a protein with highly repetitive amino-acid sequence and very low dispersion of backbone chemical shifts. Results of this measurement serve as an input data for further analysis combining NMR relaxation rates and molecular dynamics simulations.

Keywords

protein, NMR, protein structure, RNA polymerase, intrinsically disordered protein, MAP2c, relaxation, ASTEROIDS, molecular dynamics, struktura proteinu, RNA polymeráza, vnitřně neuspořádaný protein, relaxace, molekulární dynamika a simulace

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 8. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 23. 9. 2020
• Supervisor: prof. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.
• Reader: Prof. Dr. Chris Oostenbrink, doc. RNDr. Jan Lang, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biomolecular chemistry and bioinformatics / Biomolecular chemistry and bioinformatics