Izolace DNA třešně (Prunus avium L.)

Bc. Kateřina Hřebcová

Bachelor's thesis

DNA Extraction of Sweet Cherry (Prunus avium L.)

Abstract:

Základním a zásadním krokem pro všechny molekulárně-biologické studie a analýzy je izolace kvalitní DNA v dostatečném množství a čistotě. Proces její extrakce je u rostlinného materiálu komplikován přítomností látek, jako jsou např. polyfenoly, polysacharidy, proteiny nebo jiné metabolity, které při současné extrakci s nukleovými kyselinami mohou působit jako inhibitory PCR a vzorky pro další analýzy v podstatě znehodnotit.Cílem této práce bylo zmapovat používané metody izolace rostlinné DNA, metody izolace DNA třešně, a v experimentální části porovnat výsledky vybraných metod izolace rostlinné DNA z hlediska kvantity a kvality získané DNA. DNA byla izolována z různých tkání druhu Prunus avium L., konkrétně z čerstvých listů, pupenů a zmrazených embryí několika odrůd. Původním záměrem bylo porovnat výsledky získané za pomoci dvou komerčních extrakčních kitů (DNeasy Plant Mini Kit firmy Qiagen a GeneEluteTM Plant Genomic DNA Miniprep Kit firmy Sigma Aldrich). První z kitů byl nahrazen kitem pro rychlé použití DEP-25 DNA Extraction Kit firmy Top-Bio a zařazen byl též klasický protokol extrakce DNA metodou CTAB, a to ve dvou variantách bez zařazení RNázy a se zařazením RNázy do protokolu.Získané výsledky ukázaly statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými použitými metodami, a to jak z hlediska kvality tak i kvantity DNA. Předpoklad, jehož podkladem byly i literární studie, že komerční kity pro izolaci rostlinné DNA nevykazují vždy relevantní výsledky, nebyl přesvědčivě potvrzen. Klasický protokol metody CTAB pak potvrdil předpoklad získání DNA v přijatelné kvalitě i kvantitě pouze u některých tkání. Výsledky měření spektrofotometrií byly podpořeny analýzami PCR (polymerázová řetězová reakce) provedenými se získanými vzorky DNA a jsou po statistickém vyhodnocení předmětem diskuse.

Abstract:

Isolation of high quality DNA in satisfactory yield and purity is a fundamental and essential step for all molecular-biological studies and analyses. The process of its extraction can be complicated by many of materials like are polyphenols, polysaccharides, proteins and other metabolites that can be co-isolated with nucleic acids and can act as inhibitors of PCR and cause deterioration of samples for further analyses.In this thesis, mostly used methods of plant DNA isolation were mapped, and, in experimental part, results, regarded to the yield and purity, of selected plant DNA isolation methods were compared. DNA was obtained from various tissues of Prunus avium L. species, namely from fresh leaves, buds and from frozen embryos of several varieties. Comparison of the two commercial isolation kits (DNeasy Plant Mini Kit by Qiagen and GeneEluteTM Plant Genomic DNA Miniprep Kit, Sigma Aldrich) was the original intention. The first of the kits was replaced by simple and quick DEP-25 DNA Extraction Kit, Top-Bio and the experiment was extended with CTAB DNA isolation protocol, both with and without application of RNase into the protocol.The results obtained proved quite significant differences between the methods used, both in yield and purity. The original assumption, supported by several studies, that commercial kits not always gain relevant results, regarded to ability to provide pure DNA, was not accurately proven, the assumption that the CTAB protocol can gain satisfactory results according to the DNA yield and purity was proved only with some tissues. The results of the spectrophotometry were supported with polymerase chain reaction (PCR) analyses conducted with the isolated DNA samples and after statistical evaluation were discussed.

Keywords

CTAB, extrakční kity, Prunus avium L., extrakce DNA, třešeň

Keywords

sweet cherry, Prunus avium L., DNA extraction, CTAB, extraction kits

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Petr Sedlák, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Horticulture / Horticulture