Reaktivace teplotně senzitivních mutantů p53

Mgr. Jana Slováčková, Ph.D.

Doctoral thesis

Reactivation of temperature - sensitive p53 mutants

Abstract:

Nádorový supresor p53 hraje důležitou roli v prevenci nádorového onemocnění. V odpovědi na různé stresové signály p53 kontroluje základní buněčné funkce především regulací exprese svých cílových genů. Částečná nebo úplná ztráta funkce p53 se dramaticky odráží v náchylnosti buněk k maligní transformaci. Více než 50% lidských nádorů obsahuje mutaci v genu p53. Teplotně závislé (td) mutace p53 představují přibližně 10% mutací p53. Tyto mutace způsobují buď celkové snížení transaktivačních schopností p53 nebo ovlivňují transaktivaci jen některých cílových genů p53. Sledovali jsme funkční vlastnosti 23 teplotně závislých mutantů p53 získaných z nádorových tkání pacientů při analýze statutu p53 metodou FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast). U těchto mutantů p53 dochází změnou teploty v určitém rozsahu k obnovení funkce. Jednotliví td mutanti p53 se velmi liší svou teplotní závislostí, tedy teplotou, při níž dochází k obnovení jejich aktivity, a mají výrazný diskriminativní charakter, tzn. liší se mírou aktivity vůči svým cílovým genům. Analyzovali jsem transaktivační schopnosti td mutantů p53 pomocí transaktivačního luciferázového testu v přechodně transfekovaných buňkách H1299 a sledovali míru exprese endogenních cílových genů ve stabilních liniích H1299/p53 v závislosti na teplotě. Funkční vlastnosti td mutantů p53 v lidském expresním systému jsme srovnali s jejich transaktivačními schopnostmi v kvasinkách (Grochová et al., 2008) a potvrdili jsme teplotní závislost a diskriminativní povahu 17 td mutantů p53. S využitím těchto poznatků jsme td mutanty p53 rozdělili do čtyř funkčních skupin na základě jejich celkové aktivity a diskriminativity. Navzdory rozdílným expresním systémům jsme popsali podobné transaktivační schopnosti td mutantů p53, což dokládá spolehlivost a vysokou citlivost metody FASAY pro analýzu statutu genu p53. Obnovení funkce td mutantů p53 může být vedle změny teploty vyvoláno také působením různých p53-stabilizujících a re/aktivujících látek. Roskovitin je inhibitor cyklin-dependentních kináz s vysokým protinádorovým potenciálem. Studovali jsme vliv vybraných mutantů p53 na buněčnou odpověď nádorových linií H1299/p53 v důsledku působení roskovitinu. U některých nádorových linií H1299/p53 jsme pozorovali výraznou apoptotickou odpověď v permisivní a/nebo restriktivní teplotě. Je tedy pravděpodobné, že funkční status p53 ovlivňuje odpověď nádorových buněk H1299/p53 na roskovitin, ačkoli přesný mechanismus účinku roskovitinu zatím není zcela znám. Podrobné studium vlastností mutantů p53 a buněčných procesů, jež jsou p53 regulovány, umožní lepší pochopení funkce nádorového supresoru p53 v kancerogenezi a následně i vývoj účinnějších protinádorových léků.

Abstract:

The tumor suppressor p53 plays an important role in cancer prevention. In response to various stress signals, p53 controls essential cell functions by regulating expression of its target genes. Partial or full loss of the p53 function is reflected in susceptibility of cells to malignant transformation. The p53 gene is mutated in about 50% of human cancers. Temperature-dependent (td) p53 mutations represent approximately 10% of all p53 mutations. These mutations can alter general transactivation ability of the p53 protein or they modify its transactivation only towards specific genes. We analyzed function of 23 temperature-dependent p53 mutants collected from tumor samples that were earlier characterized by FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast). These td p53 mutants differed in extent of their temperature-dependency, i.e. in reactivating temperatures, and they exhibited remarkable discriminative character, i.e. they preferentially transactivated expression of certain target genes only. We addressed the transactivation activities of td p53 mutants using transactivation luciferase assay in transiently transfected H1299 cells. At the same time, we monitored expression of some endogenous p53 target genes in H1299 cell derivatives expressing p53 mutants in various temperatures. We compared the functional abilities of td p53 mutants in yeast (Grochova et al., 2008) and human cells and stratified them into four functional groups. Seventeen mutants exhibited temperature-dependency and discriminative character. Despite the differences of yeast and human cells, they allowed similar transactivation rates to the p53 mutants, thus providing evidence that FASAY is valuable tool for assessment of the human p53 status. Besides the temperature shift, td p53 mutants can be reactivated by several p53-stabilizing and re/activating agents, such as roscovitine. This agent can inhibit cyclin-dependent kinases thus possessing strong anti-tumor effects. We studied the effect of roscovitine on H1299 cell derivatives expressing the td p53 mutants. We detected clear induction of apoptosis in some roscovitine-treated H1299/p53 cell lines at permissive and/or restrictive temperature. This indicates that functional status of p53 might affect the way how cell responses to roscovitine, although the exact mode of action has not been completely elucidated yet. We conclude that detailed characterization of p53 mutants and cellular processes regulated by p53 are important prerequisites for establishing of efficient anticancer therapies.

Keywords

nádorový supresor p53, teplotně závislí mutanti p53, transaktivace, reaktivace, roskovitin

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 9. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 22. 10. 2010
• Supervisor: prof. RNDr. Jana Šmardová, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Vladimír Kryštof, Ph.D., RNDr. Marie Brázdová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology