Biofyzikální analýza mechanismu protinádorového působení nových léčiv proti rakovině

Mgr. Kristýna Stehlíková, Ph.D.

Doctoral thesis

Biophysical analysis of the mechanism of the antitumor action of new anticancer drugs

Anotácia:

Cisplatina (cis-diammindichloroplatnatý komplex) je nejdéle používaným cytostatikem na bázi platiny. Cílovým místem platinových komplexů v buňce je DNA, proto jsou intenzivně studovány biochemické a biofyzikální charakteristiky vazby těchto látek zejména na DNA. Důležitou roli v mechanismu protinádorového působení platinových komplexů hrají také opravné mechanismy v buňkách. Jednou z možných strategií při vývoji nových terapeuticky efektivnějších cytostatik je syntéza komplexů odvozených od klinicky neúčinné transplatiny (trans-diammindichloroplatnatý komplex). S využitím metod molekulární biofyziky byly studovány modifikace DNA komplexem trans-[PtCl2NH3(4-hydroxymethylpyridin)] (trans-PtHMP) a vliv tohoto komplexu na vazbu proteinu p53 na DNA. Adukty trans-PtHMP inhibují vazbu proteinu p53 na jeho konsensuální sekvenci v DNA výrazně více než adukty transplatiny. Zjištěné charakteristiky vazby trans-PtHMP na DNA jsou odlišné jak od transplatiny, tak i od cisplatiny, což může spolu s inhibicí proteinu p53 vést k jinému protinádorovému účinku této látky. Jedním z procesů, které odstraňují léze na DNA indukované komplexy kovů, je nukleotidová excizní oprava. Počátečního kroku NERu (rozpoznání poškozeného místa na DNA) se mimo jiné účastní také proteiny XPA a RPA. Mezi důležité faktory zodpovědné za vazbu proteinu XPA k poškozené DNA je změna termodynamické stability DNA indukovaná aduktem cisplatiny. Z výsledků vyplývá, že se protein XPA nejlépe váže na DNA, kde došlo vlivem aduktu cisplatiny k nejmenší termodynamické destabilizaci, zatímco protein RPA se nejlépe váže na DNA, která byla po vazbě cisplatiny nejméně stabilní. Proto protein XPA vykazoval vyšší vazebnou afinitu k oligonukleotidu obsahujícímu 1,2-d(GpG) vnitrořetězcový můstek (IAC) cisplatiny, zatímco protein RPA se více vázal na DNA obsahující 1,3-d(GpTpG) IAC. Při zkoumáni vlivu sekvence bylo zjištěno, že protein XPA vykazuje vyšší vazebnou afinitu k DNA, kde je 1,2-d(GpG) IAC cisplatiny tvořen v sekvenci AGGA než k DNA s centrální sekvencí TGGT nebo CGGC. Přes rozdílnou termodynamickou destabilizaci zkoumaných duplexů, nebyla u vazebné afinity proteinu RPA zjištěna sekvenční závislost. Při určování velikosti úhlu ohybu DNA indukovaného 1,2-d(GpG) IAC cisplatiny pomocí mikroskopie atomárních sil bylo získáno několik obrazů molekul nemodifikované i modifikované DNA. Obrazem nemodifikované DNA jsou rovné tyčinky, zatímco u modifikované DNA lze zřetelně určit ohyb způsobený 1,2-d(GpG) vnitrořetězcovým můstkem cisplatiny.

Abstract:

Cisplatin (cis-diamminedichloropaltinum(II)) is the most utilized antitumor platinum drug. DNA is the principal target for platinum complexes in cells. Therefore, the biochemical and biophysical characteristics of their binding to DNA have been extensively studied. Cell repair systems play an important role in the mechanism of antitumor action of these complexes. Limitations in use of cisplatin have motivated scientists to seek for new antitumor-active metal complexes with better pharmacological properties. Several strategies are used with this purpose. Among them, the synthesis of derivates of the clinically ineffective transplatin trans-diamminedichloroplatinum(II) is one of the most promissing means. Modifications of natural DNA by platinum complex trans-[PtCl2NH3(4-hydroxymethylpyridine)] (trans-PtHMP) and its influence on p53 binding properties were studied by methods of molecular biophysics. Adducts of trans-PtHMP inhibit binding of p53 protein to its consensus sequence in DNA considerably more than adducts of transplatin. The binding characteristics of trans-PtHMP are different from those of transplatin and also cisplatin, which, together with p53 inhibition, may lead to another antitumor effect of this drug. Nucleotide excision repair (NER) is one of the cell mechanisms removing adduct of platinum complexes from DNA. Proteins XPA nad RPA are involved in the initial step (recognition of damaged site on DNA). Important factor, which affects binding affinity of XPA and RPA to damaged DNA, is a change of thermodynamic stability of DNA induced by the damage. The growing destabilization of DNA lowers affinity of XPA to cisplatin modified DNA in contrast to RPA. The results of the present work confirm that XPA preferentially binds to DNA damaged by 1,2-d(GpG) intrastrand adduct of cisplatin and RPA preferentially binds to DNA damaged by 1,3-d(GpTpG) intrastrand adduct of cisplatin. Thus, consistent with latter findings is our observation that XPA exhibits higher binding affinity to 1,2-d(GpG) intrastrand adduct of cisplatin formed between two neighbouring guanine bases flanked by adenine bases than to the adduct flanked by cytosine or thymine bases. Binding affinity of RPA 1,2-d(GpG) intrastrand adduct of cisplatin is insensitive to alterations of thermodynamic stability of damaged DNA. Atomic force microscopy (AFM) was used to observe the bending of DNA induced by 1,2-d(GpG) intrastrand adduct of cisplatin. Preliminary results show that nonmodified DNA looks like rigid stick, while it is possible to observe the bent induced in DNA by the adduct.

Kľúčové slová

protinádorové komplexy platiny, cisplatina, DNA, XPA, RPA antitumor platinum complexes, cisplatin, RPA

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 1. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 23. 1. 2006
• Vedúci: RNDr. Jana Kašpárková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Physics / Biophysics