Příprava expresních konstruktů a odvození stabilních linií produkujících cytokininové receptory AHK2 a AHK3 z Arabidopsis thaliana

Bc. Karolína SANITRÁKOVÁ

Master's thesis

Molecular cloning and generation of stable lines expressing cytokinin receptors AHK2 and AHK3 from Arabidopsis thaliana

Abstract:

Cytokininy v rostlinách ovlivňují celou řadu dějů od dělení buněk až po senescenci. K realizaci cytokininové odpovědi dochází prostřednictvím cytokininové signalizační dráhy. Prvním krokem v cytokininové signalizační kaskádě je navázání cytokininu na cytokininový receptor. Lokalizace daných receptorů na buněčné úrovni není jednoznačná. Cílem diplomové práce bylo klonování genů cytokininových receptorů AHK2 a AHK3 a charakterizace C-terminálních AHK2-GFP a AHK3-GFP fúzí. V praktické části jsem se pak věnovala přípravě AHK2 a AHK3 konstruktů značených pomocí GFP proteinu pod kontrolou silných konstitutivních promotorů a pod kontrolou nativních promotorů. Pro rychlé ověření tvorby fúzních proteinů byla připravena protoplastová buněčná kultura Arabidopsis Ler s konstrukty 35S::AHK2:GFP nebo 35S::AHK3:GFP. Dále byly připraveny konstrukty pUBQ10::AHK2:GFP, pUBQ10::AHK3:GFP a následně bylo přistoupeno k transformaci rostlin Arabidopsis thaliana Col-0 a k odvozování stabilních homozygotních linií. V této práci se poprvé povedlo připravit gen AHK3 pod kontrolou nativního promotoru ve vektoru pMCS-GW a daný konstrukt úspěšně transformovat do rostlin A. thaliana. Dále jsem se zabývala klonováním genu BCIN_05g04530 z nekrotrofního fungálního patogenu Botrytis cinerea, který byl vybrán pro svoji strukturní a funkční podobnost s cytokininovými receptory v Arabidopsis thaliana.

Abstract:

Cytokinins affect many aspects of plant growth and development. Cytokinin response is mediated through the cytokinin signaling pathway. The first step in the cytokinin signaling cascade is the binding of cytokinin to the cytokinin receptor (AHK2, AHK3 and CRE1/AHK4 in Arabidopsis thaliana). The subcellular localization of these receptors is not clear. The aim of the thesis was the cloning of AHK2 and AHK3 genes and characterization of C-terminal AHK2-GFP and AHK3-GFP. In the theoretical part, I focused on cytokinins and their metabolism, cytokinin phosphorelay and cytokinin receptors. The practical part deals with preparation of AHK2 and AHK3 constructs tagged with GFP protein under the control of a strong constitutive promoter and under the control of native promoters. To rapidly test the production of fusion proteins, Arabidopsis Ler protoplast cell culture was transformed with A. tumefaciens carrying the 35S::AHK2:GFP or 35S::AHK3:GFP construct. Subsequently, the pUBQ10::AHK2:GFP and pUBQ10::AHK3:GFP constructs were prepared and transformed to Arabidopsis thaliana Col-0 plants and the selection of stable homozygous lines was started. In presented thesis, for the first time, it was possible to prepare the AHK3 gene under the control of its native promoter in the pMCS-GW vector and successfully transform the construct into A. thaliana plants. I also dealt with the cloning of the BCIN_05g04530 gene from the necrotrophic fungal pathogen Botrytis cinerea, which was chosen for its structural and functional similarity to cytokinin receptors in Arabidopsis thaliana.

Keywords

Arabidopsis thaliana, cytokininy, cytokininová signalizace, cytokininové receptory

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 1. 2023

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Ondřej Plíhal, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology