The role of post-transcriptional modifications of RNA in humans

Nandan Mysore Varadarajan, M.Sc.

Doctoral thesis

Abstract:

Regulace eukaryotických genů je v centru pozornosti buněčné homeostázy a má mnoho důležitých kontrolních bodů. Tyto kontrolní body určují osud čerstvě přepsané RNA a v konečném důsledku regulují biologické procesy, které jsou pro RNA důležité. Navzdory robustnosti těchto procesů mohou některé vzniklé transkripty kontrolním bodům uniknout, což vede ke vzniku "aberantní RNA". Tyto aberantní druhy RNA jsou z buněk rychle odstraněny, aby byla zachována homeostáza, a to prostřednictvím mnoha mechanismů kontroly kvality RNA. Jedna taková cesta kontroly kvality zvaná TDS (TUT-DIS3L2 surveillance) je předmětem této práce. Podal jsem přehled genové regulace prostřednictvím zpracování 3ʹ konců a regulace založené na RISC (RNA induced silence complex). Nastínil jsem také úlohu hnRNPC (heterogenous nuclear ribonuclear protein-C) v genové regulaci v kontextu srdečních patologií. Bylo zjištěno, že TDS rozpoznává širokou škálu RNA substrátů, a proto jsem se zaměřil na charakterizaci jednoho substrátu pocházejícího z místa startu transkripce mRNA. Zjistili jsme, že tyto fragmenty mRNA (mRF) unikly cestě jaderné kontroly kvality. Ukázali jsme take uridylační stav mRFs na úrovni buněčného kompartmentu, který nakonec vede k degradaci pomocí DIS3L2 (DIS3 like 3'-5' exoribonukleáza 2). Identifikoval jsem některé potenciální kofaktory, které pomáhají při zpracování, transportu a/nebo degradaci těchto mRFs. Předchozí studie ukázaly, že některé z těchto mRFs mohou tvořit malé funkční RNA. Proto jsme se zaměřili na identifikaci nových "vodicích" RNA navázaných na hAgo2. Zjistili jsme více než 600 diferenciálně exprimovaných nových "vodicích" RNA navázaných na hAgo2 při DIS3L2 KO (knockout), což zdůrazňuje význam TDS při regulaci těchto nových molekul. V rámci rozšíření naší studie o malé RNA jsem se podílel na společném projektu, který využíval soubor dat hAgo2 CLASH (Argonaut 2 Crosslinking, Ligation and Sequencing of Hybrids) a robustní pipeline k identifikaci tisíců "vodících" RNA odvozených od jiných malých RNA a k identifikaci interakcí "vodící RNA-cíl" s vysokou důvěrou. Některé z těchto dvojic "vodící RNA-cíl" byly experimentálně ověřeny. Náš zájem o hnRNPC (heterogenní jaderný ribonukleoprotein C) jako jeden z kofaktorů poly- uridylované RNA nás navíc přiměl ke spolupráci s laboratoří Dr. Giancarla Forteho. Výsledkem naší spolupráce byla charakterizace RNA substrátů od hnRNPC a komplexní pochopení úlohy hnRNPC v alternativním sestřihu mRNA podílejících se na mechanotransdukci a na kardiovaskulárních onemocněních. Můj přínos k této práci byl v dizertační práci zdůrazněn.

Abstract:

Eukaryotic gene regulation takes centre stage in cellular homeostasis and has many important check points. The fate of a freshly transcribed RNA is determined by these check points, ultimately regulating the biological processes that are consequential to the RNA. Despite the robustness of these processes some of the transcripts produced may escape these check points leading to formation of “aberrant RNA”. These aberrant RNA species are quickly cleared from the cells to maintain homeostasis, via a multitude of RNA quality control machineries. One such quality control pathway called TDS (TUT-DIS3L2 surveillance) is the focus of this thesis. In this thesis I have given an overview of gene regulation via 3ʹ end processing and RISC (RNA induced silence complex) based regulation. I have also outlined the role of hnRNPC (heterogenous nuclear ribonuclear protein-C) in gene regulation in the context of cardiac pathologies. TDS has been identified to recognize a wide range of RNA substrates, to this end I aimed to characterize one such puzzling substrate originating from transcription start site of mRNAs. Interestingly, we observed that these 5ʹ mRNA fragments (mRFs) escape the nuclear quality control pathway. We also demonstrated the uridylation status of mRFs at cellular compartment level eventually leading to degradation by DIS3L2(DIS3 like 3'-5' exoribonuclease 2). I identified some of the potential cofactors that help in processing, transport and/or degradation of these mRFs. Previous studies have shown that some of these mRFs can form functional small RNAs. To this end we aimed to identify novel ‘guide’ RNAs loaded to hAgo2. We detected >600 differentially expressed novel hAgo2 loaded ‘guide’ RNAs upon DIS3L2 KO (knockout), highlighting the importance of TDS in regulating these novel molecules. Extending our study on small RNAs, I participated in a collaborative project which utilized hAgo2 CLASH (Argonaut 2 Crosslinking, Ligation and Sequencing of Hybrids) data set and a robust pipeline to identify thousands of “guides” derived from other small RNAs and high confidence “guide-target” interactions. Some of these “guide-Target” pairs were experimentally validated. Additionally, our interest in hnRNPC (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C) as one of the cofactors of poly-uridylated RNA prompted us to collaborate with Dr. Giancarlo Forte lab. Our collaboration resulted in characterization of hnRNPC RNA substrates and a comprehensive understanding of the role of hnRNPC in alternative splicing of mRNAs involved in mechanotransduction and cardiovascular diseases. My contributions to this work have been highlighted in this thesis.

Keywords

Regulace genové exprese, DIS3L2, uridylace, TUTázy, TDS, TSSas, 5'mRF, degradace RNA, Ago2, genová kontrola zprostředkovaná RISC, hnRNPC. Regulation of gene expression, Uridylation, TUTases, RNA degradation, RISC mediated gene control, hnRNPC.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 2. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 11. 4. 2024
• Supervisor: prof. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.
• Reader: RNDr. Zdeněk Paris, Ph.D., prof. Mgr. David Staněk, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biomolecular chemistry and bioinformatics / Biomolecular chemistry and bioinformatics