Analýza významu epigenetické regulace exprese AGR2 ve vztahu ke tvorbě metastáz u vybraných nádorových buněčných linií

Bc. Andrea Martišová

Master's thesis

Determination of epigenetic regulation of AGR2 expression in relation to metastasis development in selected cancer cell lines

Abstract:

Epigenetické změny jsou asociovány v podstatě s každým krokem progrese rakoviny včetně metastatické kaskády. Aberantní hypermethylace CpG dinukleotidů uvnitř promotorů obvykle vede k inaktivaci transkripce. Předpokládá se, že epiteliálně-mezenchymální tranzice (EMT) je jedním ze základních kroků metastatické kaskády. Tento proces je přechodný, reverzibilní a také ovlivněný metylací DNA. Bylo popsáno, že Anterior gradient 2 (AGR2) hraje významnou roli v mnoha buněčných procesech, včetně přežití nádorových buněk, proliferace a rezistence k léčbě. Kromě toho bylo také potvrzeno, že protein AGR2 zásadním způsobem přispívá k udržování epiteliálního fenotypu. Předpokládáme, že exprese AGR2 by mohla být mj. regulována i epigeneticky, konkrétně DNA metylací během procesu EMT, respektive během reverzního procesu mezenchymálně-epiteliální tranzice (MET). Ukázali jsme, že hladiny AGR2 jsou indukovatelné na úrovni mRNA i proteinu působením 5‑Aza‑2´‑deoxycytidinu (AZA, inhibitor DNA methyltransferáz). Sangerovým sekvenováním po bisulfitové konverzi jsme demonstrovali, že AGR2 promotor je odlišně metylován v panelu analyzovaných buněčných linií. Intenzita metylací klesala po působení AZA, což koreluje s jeho známým účinkem – celogenomovou demetylací. Poté jsme také analyzovali efekt dalších látek indukujících buď MET (kyselina All-trans retinová, ATRA; butyrát sodný, NAB) nebo EMT (Phorbol 12‑myristát 13-acetát, PMA; TGF-β) vzhledem ke změnám hladin epiteliálních a mezenchymálních markerů a AGR2. Zjistili jsme, že tyto látky mohou také ovlivnit metylaci DNA. Vybrali jsme buněčnou linii MDA‑MB‑231, která má mezenchymální morfologii a v ní analyzovali promotorovou oblast genu AGR2 sekvenováním klonovaných alel s cílem identifikovat specifické metylační vzory spojené s výše uvedenými látkami. Zjevné změny v hladinách proteinů byly pozorovány především po působení NAB, inhibitoru histon deacetyláz, který může také ovlivňovat metylaci DNA, avšak ne jednotným způsobem. Navzdory našemu očekávání jsme u buněk MDA-MB-231 detekovali zvýšenou míru metylace po působení ATRA a NAB a sníženou po PMA, zatímco po TGF-β jsme nepozorovali výraznější změny. Naše výsledky ukazují, že promotor AGR2 je odlišně metylován a že intenzita metylace většinou koreluje s mírou exprese tohoto proteinu bez ohledu na to, zda buňky byly či nebyly vystaveny působení AZA.

Abstract:

Epigenetic changes are associated with each step of cancer progression and metastatic cascade. Aberrant hypermethylation of CpG dinucleotides inside promoters leads to transcriptional inactivation. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is believed to be one of the essential steps of the metastatic cascade. This process is transient, reversible and also influenced by DNA methylation. Anterior gradient 2 (AGR2) was described to have a role in many cellular processes including cancer cell survival, proliferation, and drug resistance. Moreover, AGR2 was also described as the keeper of the epithelial phenotype. We hypothesise that AGR2 could be regulated by epigenetics and more precisely by DNA methylation during the process of EMT and its possible reversion process mesenchymal-epithelial transition (MET). We showed that AGR2 levels are inducible on both mRNA and protein level by 5-Aza-2´-deoxycytidine (AZA), a DNA methyltransferase inhibitor. By direct Sanger sequencing after bisulfite conversion, we demonstrated that AGR2 promoter is differentially methylated in the panel of analysed cell lines. This methylation status decreases after AZA treatment which correlates with its known effect - the genome-wide demethylation. Afterwards, we also analysed various treatments leading to either MET (All-trans retinoic acid, ATRA; Sodium butyrate, NAB) or EMT (Phorbol 12‑myristate 13-acetate, PMA; TGF‑β) and their effects on epithelial and mesenchymal markers and AGR2. We found that these treatments can also influence DNA methylation. We chose MDA-MB-231 cell line showing mesenchymal morphology and analysed its AGR2 promoter region by sequencing of cloned alleles to identify specific methylation patterns associated with above-mentioned treatments. Apparent changes in protein levels were observed predominantly in response to NAB, a well-known histone deacetylase inhibitor which can also influence DNA methylation, however, not in a uniform fashion. Surprisingly, in MDA-MB-231 we detected an increased rate of methylation after ATRA and NAB and lowered after PMA while TGF-β left promoter mostly unchanged. Our findings indicate that AGR2 promoter is differentially methylated and that this methylation mostly correlates with its rate of expression in both untreated and AZA treated cells.

Keywords

AGR2, epiteliálně-mezenchymální tranzice, epigenetika, DNA metylace, bisulfitová konverze, epithelial-mesenchymal transition, epigenetics, DNA methylation, bisulfite conversion

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 6. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 9. 7. 2020
• Supervisor: doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.
• Reader: Joanna Obacz, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Genomics and Proteomics