Selektivní stanovení bifidobakterií v potravních doplňcích a mléčných kysaných výrobcích

Tereza Jehličková

Diplomová práce

Selective enumeration of bifidobacteria in food supplements and fermented milk products

Anotace:

Tato práce "Selektivní stanovení bifidobakterií v potravních doplňcích a mléčných kysaných výrobcích" je orientována na otestování médií určených ke kvantifikaci rodu Bifidobacterium a navržení nových, druhově specifických médií určených pro druhy Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum a Bifidobacterium breve. V této práci byly otestovány čisté kultury rodu Bifidobacterium, dále 16 komerčně dostupných probiotických výrobků, z toho 13 doplňků stravy a 3 jogurty. Testování bylo provedeno na 5 pěstebních prostředích určených ke kvantifikaci rodu Bifidobacterium, tedy na normou ISO 29981/IDF 220:2010 (Merck, Německo) doporučeném TOS médiu doplněném o antibiotikum mupirocin (100 mg/l), TOS médiu (Yakult), komerčně vyráběném BSM médiu (Sigma-Aldrich), BSM médiu doplněném o mupirocin (100 mg/l) a na Wilkins--Chalgren (Oxoid) agaru s mupirocinem (100 mg/l) doplněném o sójový pepton (5 g/l), L-cystein (0,5 g/l), Tween 80 (1 ml/l) a ledovou kyselinu octovou (1 ml/l), což je komerčně připravený agar, který byl modifikovaný na katedře mikrobiologie, výživy a dietetiky, ČZU. Dále byla navržena druhově specifická média: mupirocin-turanosa médium (MT), manitol-sorbitol-mupirocin médium (MSM) a mupirocin-mucin médium (MM). Sacharidy použité v sestavených druhově specifických médiích slouží jako selektivní faktory pro konkrétní druhy bifidobakterií. Tato práce se zaměřuje na sledování schopnosti růstu jednotlivých druhů bifidobakterií na těchto výše zmíněných pěstebních prostředích. Z výsledků této práce vyplývá, že nejvyšší počty bifidobakterií rostly na TOS médiu bez mupirocinu. Tento výsledek byl však dán tím, že na TOS médiu bez mupirocinu byly později identifikovány i jiné bakterie než jen bakterie rodu Bifidobacterium. TOS médium je tedy méně selektivní než ostatní doporučovaná média pro kvantifikaci rodu Bifidobacterium obohacená o mupirocin (100 mg/l), kde všechny izoláty byly identifikovány jako rod Bifidobacterium. Izoláty pocházející z komerčně dostupných probiotických doplňků stravy a z jogurtů, byly identifikovány na úroveň rodu a druhu. Rodová identifikace byla provedena pomocí detekce enzymu fruktoso-6-fosfát fosfoketolasy (F6PPK), což je enzym specifický pro rod Bifidobacterium. Druhová identifikace byla pak provedena pomocí molekulárně genetických metod, konkrétně se jednalo o polymerázovou řetězovou reakci (PCR), za použití rodově specifických primerů. Při sestavování druhově specifických médií bylo vycházeno z biochemických testů API 50 CHL a ANAEROtest 23, pomocí kterých byly zjištěny substrátové preference konkrétních druhů bifidobakterií nebo bylo vycházeno z již známých faktů (utilizace mucinu), v případě Bifidobacterium bifidum. Druhově specifická média byla sestavena pro Bifidobacterium bifidum, kde byl jako zdroj uhlíku a zároveň selektivní faktor vybrán mucin (20 g/l). Toto médium bylo ještě pro zvýšení selektivity doplněno o mupirocin (100 mg/l). Pro Bifidobacrterium longum bylo navrženo médium doplněné o turanosu (10 g/l) a mupirocin (100 mg/l). Pro Bifidobacterium breve bylo navrženo médium doplněné o manitol (10 g/l), sorbitol (10 g/l) a mupirocin (100 mg/l). Nejvíce selektivní se ukázalo médium navržené pro Bifidobacterium bifidum, kde bylo Bifidobacterium bifidum identifikováno v 79 %, na médiu pro Bifidobacterium longum byl tento druh identifikován v 67 % a na médiu navrženém pro Bifidobacterium breve byl tento druh identifikován v 71 %. Ani jedno z nově navržených druhově specifických médií nebylo zcela selektivní, nicméně pro Bifidobacterium bifidum se tedy jako perspektivní jeví médium obohacené o mucin a mupirocin, pro Bifidobacterium longum se jako perspektivní jeví médium obohacené o turanosu a mupirocin a pro Bifidobacterium

Anotace:

breve se jako perspektivní jeví médium obohacené o sorbitol, manitol a mupirocin. Poslední část této práce je věnovaná ověření informací uvedených na obalech komerčně dostupných probiotických preparátů, tedy ověření faktu, zda se informace uvedené na obalech shodují s výsledky identifikace izolátů z těchto výrobků provedené v rámci této práce. Deklarované druhy bifidobakterií byly identifikovány, ale v některých výrobcích identifikace potvrdila i výskyt druhů, které na obale uvedeny nebyly.

Abstract:

The aim of this study, "Selective enumeration of bifidobacteria in food supplements and fermented milk products" was to test media designed for quantification of the genus Bifidobacterium and also preparing new species-specific media for Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum and Bifidobacterium breve species. In this study, the pure culture of Bifidobacterium as well as 16 commercially available probiotic products, 13 probiotics supplements and 3 yogurts, were tested. The testing was performed on five cultivation media designed to quantify the genus Bifidobacterium: the standard ISO 29981/IDF 220:2010 (Merck, Germany) recommended TOS medium enriched by the antibiotic mupirocin (100 mg/l), TOS medium (Yakult), commercially produced BSM medium (Sigma-Aldrich), BSM medium enriched mupirocin (100 mg/l) and Wilkins- Chalgren (Oxoid) agar with mupirocin (100 mg/l). Wilkins-Chalgren (Oxoid) agar was also supplemented with soy peptone (5 g/l), L-cysteine (0,5 g/l), Tween 80 (1 ml/l) and glacial acetic acid (1 ml/l), which is a commercially prepared agar, modified at the Department of Microbiology, Nutrition and Dietetics, Czech University of Life Sciences Prague. Furthermore the specific-species media were designed and produced. Mupirocin, turanose medium (MT), mannitol, sorbitol, mupirocin medium (MSM) and mupirocin, mucin medium (MM). Carbohydrates used in specific-species media were used as selective factors for specific species of Bifidobacteria. This study focused on observing ability of growth of different species of bifidobacteria in these previously mentioned cultivation media. The results of this study show, that the highest numbers of bifidobacteria appeared on the TOS medium without mupirocin. This result was given through the fact, that on the TOS medium without mupirocin, bacterial genera other, than bifidobacteria were identified. TOS medium is thus less selective than the other recommended media proposed for quantifying of the genus Bifidobacterium enriched with mupirocin (100 mg/l), where all isolates were identified as genus Bifidobacterium. Isolates from commercially available probiotic supplements and also isolates from yogurts were identified to the genus and species level. The genus identification was carried out by the detection of fructose-6-phosphate fosfoketolase (F6PPK), which is an enzyme specific for the genus Bifidobacterium. Species identification was made by using molecular genetic techniques, specifically a polymerase chain reaction (PCR), using the genus specific primers. Specific-species media were constructed on the base of the information that came from a biochemical test API 50 CHL and ANAEROtest 23, throught which the substrate preferences of specific bifidobacterial species were detected, or in the case of Bifidobacterium bifidum the result from already known facts (utilization of mucin). Specific-species medium was prepared for Bifidobacterium bifidum, where mucin (20g/l) was the sole carbon source as a selective factor. Mupirocin (100 mg/l) was an additional selective factor. For Bifidobacrterium longum, the medium supplemented with turanose (10 g/l) and mupirocin (100 mg/l) was prepared. For Bifidobacterium breve, the medium supplemented with mannitol (10 g/l), sorbitol (10 g/l) and mupirocin (100 mg/l) was prepared. The most selective medium was the medium designed for Bifidobacterium bifidum, where the Bifidobacterium bifidum has been identified in 79 %, on a medium for Bifidobacterium longum, specific species was identified in 67 % and on a medium designed for Bifidobacterium breve specific species was identified in 71 %. Neither of the newly designed specific-species media were entirely selective, however, Bifidobacterium bifidum appears to be a perspective medium supplemented with mucin and mupirocin. For Bifidobacterium longum a perspective medium seems to be the medium supplemented with turanose and mupirocin and for Bifidobacterium breve a perspective medium seems to be the m

Abstract:

edium enriched by sorbitol, mannitol, and mupirocin. The last aim of this study was verification of the information on the packaging of commercially available probiotics, thus verifying the fact that the information on the packaging are in line with the results of identification of isolates of these products made in this study. Declared bifidobacteria species were identified, but in some cases other species which were not mentioned on the packaging were also found.

Klíčová slova

Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, selektivní agary, jogurt

Keywords

Bifidobaacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Selective media, Yogurt

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 4. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Ing. Vojtěch Rada, CSc.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Výživa a potraviny / Výživa a potraviny