Úloha antimikrobiálních peptidů v imunitní obraně včel při infekcích bakteriálními patogeny

Bc. Silvie DOSTÁLKOVÁ

Diplomová práce

The role of antimicrobial peptides in bee immune responses to infections by bacterial pathogens

Anotace:

Nedílnou součástí imunitního systému hmyzu jsou rychlé a nespecifické reakce humorálního imunitního systému, při nichž se uplatňují lektiny, lysozym, fenoloxidasa a antimikrobiální peptidy. Mezi zástupce včelích antimikrobiálních peptidů patří peptidy apidaeciny, abaecin, defensiny a jelleiny. V této práci byl optimalizován protokol pro stanovení antimikrobiální aktivity peptidů apidaecinu Ia vůči bakteriálnímu kmenu Escherichia coli a jelleinů I a II vůči 9 různým bakteriálním kmenům Paenibacillus larvae, který je původcem závažného onemocnění moru včelího plodu. Antimikrobiální účinek peptidů byl sledován měřením růstových křivek bakterií v tekutém médiu. Antimikrobiální účinek jelleinu I a II nebyl vůči testovaným kmenům P. larvae prokázán. Pro kvantifikaci počtu živých a mrtvých bakteriálních buněk po aplikaci antimikrobiálních látek byly zavedeny citlivější metody fluorescenční a luminiscenční. Hodnoty fluorescenčního poměru získané testováním pomocí fluorescein diacetátu a propidium jodidu nevykazovaly linearitu regrese mezi hodnotami fluorescenčního poměru a hodnotami životnosti buněk, navíc fluorescenční signál fluorescein diacetátu byl velice nízký. Naopak stanovení životnosti buněk pomocí resazurinu bylo optimalizováno pro zjištění životnosti bakterií po jejich inkubaci s antimikrobiální látkou. Při měření luminiscence komerčním kitem (BacTiter-GloTM Microbial Cell Viability Assay, Promega) ošetřených bakteriálních vzorků ošetřených peptidem nebo antibiotikem byl na počátku měření pozorovaný prudký nárůst koncentrace ATP. Byl zaveden chov včel in vitro, kdy experimentální včely byly využity pro studium exprese genů pro MRJP proteiny (major royal jelly proteins), z nichž MRJP1 je prekurzorovým proteinem jelleinů. Pro měření exprese genů byl optimalizován protokol pro izolaci RNA ze vzorků včelích hlav, přepisu do cDNA a byly navrženy primery pro geny MRJP proteinů. Včely krmené 30% sacharosou, pylem a patogenem Ascosphaera apis měli sníženou expresi genů Mrjp1 a Mrjp2 ve srovnání s kontrolní skupinou, včely krmené 30% sacharosou, pylem a patogenem P. larvae CCM 4483 měli sníženou expresi genů Mrjp2 v porovnání se včelami krmenými jen 30% sacharosou a pylem. U včel, které byly krmeny stejným patogenem, ale bez přídavku pylu, nebyla exprese genu Mrjp2 signifikantně odlišná od kontrolní skupiny.

Abstract:

Nonspecific and fast reactions of humoral immunity are an integral part of insect immune system. Lectins, lysozymes, phenoloxidase and antimicrobial peptides belong to humoral immunity and play essential role in immune system. The representatives of bee antimicrobial peptides include peptides apidaecins, abaecin, defensins and jelleines. In this work an optimized protocol was developed for determining the antimicrobial activity of the peptides apidaecin Ia against bacterial strains of Escherichia coli and jelleines I and II against 9 bacterial strains of Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood disease. The antimicrobial effect of the peptides was monitored by measuring the growth curves of the bacteria in liquid medium. No antimicrobial effect of jellein I and II against tested strains of P. larvae was monitored. To quantify the number of live and dead bacterial cells after aplication of antimicrobial substances, more sensitive fluorescence and luminescence methods were introduced. The values of fluorescence ratio obtained by testing with fluorescein diacetate and propidium iodide did not show linearity with viability of the cells, in addition the fluorescence signal of fluorescein diacetate was very low. On the other hand, determination of cell viability by fluorescent dye resazurin was optimized for the detection of bacterial viability after incubation with an antimicrobial substance. During the measurement of luminescence using a commercial kit (Bacteria-GloTM Microbial Cell Viability Assay, Promega) on bacterial samples treated with peptides or antibiotics, a fast increase in the concentration of ATP was observed at the beginning of the measurements. Method for rearing bees in vitro was introduced when experimental groups of bees were used for studying the expression of genes for MRJP proteins, among which the MRJP1 is precursor protein of jelleines. For the measurement of gene expression protocols have been optimized for RNA isolation from bee heads, transcription into cDNA and primers were designed for the genes of MRJP proteins. Bees fed with 30% sucrose, pollen and pathogen Ascosphaera apis had decreased expression of the genes Mrjp1 and Mrjp2 compared to control group, bees fed with 30% sucrose, pollen and pathogen P. larvae CCM 4483 had downregulated expression of genes Mrjp2 in comparison to bees fed only 30% sucrose and pollen. Bees fed the same pathogen, but without addition of pollen did not significantly different in gene expression of Mrjp2 from the control group.

Klíčová slova

včela medonosná, antimikrobiální peptidy, jelleiny, Paenibacillus larvae, MRJP proteiny

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 4. 2016

Zveřejnit od: 25. 4. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Mgr. Marek Petřivalský, Dr.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie