Luminiscenční měření aktivity peroxidasy

Mgr. Matěj Pastucha

Bachelor's thesis

Luminescent measurement of peroxidase activity

Abstract:

Tato bakalářská práce se věnuje chemiluminiscenční technice stanovení aktivity peroxidasy a koncentrace peroxidu vodíku. V teoretické části je obecně pojednáno o chemiluminiscenci jako takové a možnostech jejího analytického využití. Blíže se zaměřuje na peroxidasou katalyzovanou reakci peroxidu vodíku s luminolem, která je poté využívána v praktické části. V rámci praktické části byl sestaven funkční luminometr pro průtočné měření koncentrace peroxidu vodíku využívající enzymovou kolonku umístěnou přímo před fotonásobičem a byl stanoven vliv složení pracovního roztoku na měření. Fosfátový pufr byl trochu vhodnější než Tris, optimální pH bylo kolem 8,5. Se stoupající koncentrací luminolu rostly odezvy až do koncentrace 4mmol∙l-1. Přidání fenolického enhanceru, p-fenylfenolu, vedlo až k šestinásobnému zesílení signálu. Nezbytnou podmínkou pro získání lineární kalibrace a nízkého limitu detekce bylo použití dostatečně aktivní peroxidasy. Limit detekce byl kolem 1μM.

Abstract:

In this bachelor thesis we study chemiluminescent techniques for measurement of peroxidase activity and hydrogen peroxide concentration. In the theoretical part, chemiluminescence and possibilities of its analytical application are described in general terms. It focuses on peroxidase catalysed reaction of hydrogen peroxide and luminol, which is then used in the practical part. In the practical part, an operational luminometer for flow measurement of hydrogen peroxide concentration was built. It used enzymatic column placed directly in front of a photomultiplier. Effects of working solution composition were assessed. Use of phosphate buffer was a little more convenient than Tris, pH optimum was around 8,5. Signal increased with increasing concentration of luminol till 4mmol∙l-1. Addition of a phenolic enhancer, p-phenylphenol brought up to 6-times higher signals. Using enough active peroxidase was an absolute necessity for obtaining linear calibration and low detection limit - which was around 1μM.

Keywords

Chemiluminiscence, Peroxidasa, HRP, Peroxid, Luminol, Biosenzor, Průtočná analýza, Chemiluminescence, Peroxidase, Peroxide, Biosensor, Flow analysis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 19. 6. 2012
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry