Analýza molekulárně genetických změn u pacientů s akutní myeloidní leukemií

Bc. Veronika SMUTNÁ

Diplomová práce

Analysis of molecular genetic changes in patients with acute myeloid leukemia

Anotace:

Akutní myeloidní leukemie (AML) představuje klonální maligní onemocnění hematopoetické tkáně. Vzhledem k velice variabilnímu průběhu je důležité umět rozlišit v rámci AML podtypy, které se vyznačují odlišnou prognózou a tedy i léčebným přístupem. Početná skupina AML s normálním karyotypem (AML s NK) je specifická cytogenetická skupina AML, která zahrnuje pacienty s horší, ale také s lepší než střední prognózou, do které by se v době diagnózy řadili dle cytogenetického vyšetření. Pacienty s AML s NK lze klasifikovat do podskupin s odlišnou prognózou dle mutačního profilu vybraných genů. Molekulární klasifikace AML s NK se zatím opírá o 3 geny: NPM1 (nucleophosmin 1), CEBPA (CCAAT/enhancer binding protein alpha) a FLT3 (fms-related tyrosine kinase 3). Nedávno byly u AML s NK popsány mutace v genech IDH1 a IDH2 (isocitrate dehydrogenase 1 a 2). Lze předpokládat, že po důkladném zhodnocení by si IDH1/2 mutace mohly najít místo v klasifikaci AML a uplatnit se při stanovení prognózy onemocnění resp. jako markery při sledování minimální reziduální nemoci (MRD), podobně jako geny NPM1 a CEBPA. Předložená diplomová práce byla zaměřena na studium nových molekulárních markerů u AML v souboru 60 pacientů diagnostikovaných a léčených jako AML s NK na Hemato-onkologické klinice Fakultní nemocnice a Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. S cílem zjistit frekvenci výskytu IDH1/2 mutací v souboru pacientů byla provedena přímá sekvenační analýza mutačních hotspotů obou genů. Molekulární studie potvrdily opakovaný výskyt IDH1/2 mutací u AML s NK. V další části experimentální práce byly optimalizovány podmínky alelově specifické PCR (AS-PCR) pro detekci bodových mutací v kodonu R132 genu IDH1. Cílem této části práce bylo srovnání přímé sekvenační analýzy s další diagnostickou metodou, která by nahradila časově a ekonomicky náročnou sekvenační analýzu v rutinní diagnostické praxi. Zavedená multiplexní AS-PCR umožňuje na základě jednoduchého laboratorního testu vyšetřit současně 2 typy IDH1(R132) mutací a dokáže identifikovat i minoritní zastoupení mutantních alel. Vzhledem k vysoké citlivosti může najít uplatnění jak při diagnostickém vyšetření, tak při sledování MRD u pacientů s diagnostickým nálezem IDH1(R132) mutací.

Abstract:

Acute myeloid leukemia (AML) is clonal, malignant disease of hematopoietic tissue. Due to the highly variable outcome, it is important to be able to distinguish between AML subtypes of different prognosis and treatment modalities. The large group of AML with normal karyotype (NK-AML) is a specific cytogenetic AML subgroup that comprises patients with prognosis even worse or better than the intermediate prognosis determined by the cytogenetic analysis. Patients with NK-AML can be classified into subgroups of different prognosis according to the mutational profile of specific genes. Molecular classification of NK-AML is currently based on 3 genes: NPM1 (nucleophosmin 1), CEBPA (CCAAT/enhancer binding protein alpha) and FLT3 (FMS-related tyrosine kinase 3). Mutations in isocitrate dehydrogenase 1 and 2 (IDH1 and IDH2) genes were recently described in NK-AML. It is assumed, that after careful evaluation, IDH1/2 mutations might be implicated in classification and prognostic stratification of AML as well as like markers of minimal residual disease (MRD) in a similar way, like NPM1 and CEBPA genes respectively. This thesis was focused on the study of new molecular markers in AML in the group of 60 patients diagnosed and treated as NK-AML at the Department of Hemato-Oncology, University Hospital and Faculty of Medicine of Palacky University Olomouc. In order to determine the frequency of both IDH1 and IDH2 mutations in a cohort of patients, a direct sequencing analysis of mutational hotspots was performed. Molecular studies confirmed recurrent IDH1/2 mutations in NK-AML. As part of additional experiments, an allele-specific PCR (AS-PCR) for detection of point mutations in R132 codon of IDH1 gene was optimized. The aim was to compare direct sequencing analysis with an alternative diagnostic tool enabling to replace a time-consuming and expensive sequencing analysis in daily diagnostic practice. An established multiplex AS-PCR test allows simultaneous examination of two types of IDH1(R132) mutations in a single test tube and enables identification even minor proportion of mutant alleles. Therefore it might be implicated both as a diagnostic test for IDH1(R132) mutations as well as in monitoring of MRD in IDH1(R132) positive patients.

Klíčová slova

Akutní myeloidní leukemie, AML s NK, IDH1, IDH2, IDH1(R132), AS-PCR

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 4. 2012

Zveřejnit od: 30. 4. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Prof. RNDr. Marie Jarošová, CSc.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie