Rozlišení DNA modifikované protinádorově účinnými komplexy platiny proteiny HMB: studie závislosti afinity na sekvenci DNA

Mgr. Kateřina Chválová, Ph.D.

Disertační práce

Recognition by cellular proteins of DNA modified by antitumor platinum compounds

Anotace:

Cis-diammindichloroplatnatý(II) komplex (cisplatina) představuje jedno z nejčastěji používaných léčiv pro terapii nádorů, zejména nádorů varlat a vaječníků. Za klíčovou pro cytotoxické působení cisplatiny je považována tvorba aduktů cisplatiny na DNA, které mají vliv na celou řadu buněčných funkcí souvisejících s DNA. Četné výzkumy prokázaly, že protinádorová účinnost cisplatiny je zprostředkována řadou buněčných proteinů, které rozpoznávají tyto adukty. V naší práci jsme se zabývali rozpoznáním aduktů DNA-platina různými buněčnými proteiny ve snaze přispět k objasnění mechanismu účinku platinových komplexů. V první časti disertační práce byla testována hypotéza, zda GG-adukt cisplatiny může být místem atraktivním pro HMG doménu transkripčního faktoru lymphoid enhancer faktor 1 (LEF-1) a tím ho odvádět z jeho přirozeného místa působení. Za tímto účelem byla zjišťována vazebná afinita série oligonukleotidů s 25 páry bazí obsahujících uprostřed sekvenci dvou guaninů, která byla modifikována cisplatinou či zůstala nemodifikována. Vazebné afinity byly srovnány s vazebnou afinitou pro oligonukleotid stejné délky, ale obsahující konsensuální sekvenci o délce 9 páru bazí. Naše výsledky ukázaly, ze cisplatinou modifikované GG-adukty představují slabé ale specifické cílové místo pro vazbu HMG domény proteinu LEF-1. Vazebná afinita k oligonukleotidům obsahujícím GG-adukty byla 3-6 krát vyšší než v případě nemodifikovaných oligonukleotidů, avšak zhruba o řád nižší než vazebná afinita ke konsensuální sekvenci. Báze sousedící s GG sekvencí mají viditelný vliv na vazebnou afinitu. Proto bylo usouzeno, že ohnutí DNA vyvolané vazbou cisplatiny na GG sekvenci představuje místo atraktivní pro vazbu HMG domény proteinu LEF-1, ačkoliv platinovaná DNA pravděpodobně není významným kompetitorem pro přirozeně se vyskytující konsensuální sekvenci. V druhé části disertační práce jsme se zabývali analýzou duplexu obsahujícího jeden specifický adukt nadějného trinukleárního platinového komplexu BBR3464 pomocí metody footprintu za využití enzymu deoxyribonukleázy I (DNáza I). Výsledky byly srovnány s footprintem aduktů cisplatiny. Ukázalo se, že řada strukturálních změn vyvolaná vazbou platiny ve velkém žlábku vedla ke změnám v malém žlábku a tímto umožnila jejich detekci pomocí DNázy I, která po vazbě do malého žlábku B-DNA štěpí cukrfosfátovou kostru DNA. Výsledky demonstrují, že DNáza I je velmi citlivá na změny konformace vyvolané platinovými komplexy a platinové adukty, které vyvolávají rozdílné konformační změny, jsou rozpoznávány odlišným způsobem DNázou I. Ve třetí části naší práce jsme zjišťovali, zda dochází při působení cisplatiny k vytvoření kovalentní vazby mezi DNA, platinou a proteinem a zda tyto ternární komplexy mohou mít vliv na cytotoxicitu tohoto léčiva. Schopnost vytvářet tyto ternární komplexy byla studována též u klinicky inaktivního izomeru cisplatiny-transplatiny. Výsledky ukazují, že cisplatina je mnohem účinnější ve tvorbě ternárních komplexů než transplatina a tyto komplexy viditelně inhibovaly translézovou syntézu i opravu DNA, což je základní předpoklad pro vytvoření aduktů s dobrou cytotoxickou aktivitou. V poslední části disertační práce jsme ověřovali stabilitu 1,2- vnitrořetězcových GG-aduktů vytvořených cisplatinou uvnitř desetimeru d(GCCG*G*GTCGC)-d(GCGACCCGGC) a uvnitř telomerické sekvence (TTAGGG)4 obsahujicí 4 formy třech sousedících guaninů. Zjistili jsme, že GG-adukty vytvořené na GGG sekvenci jsou nestálé a vyvíjí se v průběhu času s poločasem desítek dní v našich experimentálních podmínkách. Relativní stabilita 1,2-GG a 2,3-GG vnitrořetězcových aduktů závis

Anotace:

í na bazích sousedících se sekvencí GGG.

Abstract:

cis-diamminedichloroplatinum(II) (cisplatin) represents one of the most widely used drugs for the treatment of cancer, especially testicular and ovarian cancer. There is convincing evidence that the cytotoxic properties of cisplatin are a consequence of DNA-adduct formation, which affects DNA-dependent cellular functions. It is generally accepted that the antitumor activity of cisplatin is mediated by recognition of its DNA adducts by cellular proteins. In our work we studied the recognition of DNA-platinum cross-links by different cellular proteins in order to contribute to the better understanding of the mechanism of action of platinum compounds. The possibility that cisplatin-GG crosslink could hijack the HMG-box containing transcription factor lymphoid enhancer factor 1 (LEF-1) was tested. The electrophoretic mobility shift assay was used to determine the affinity of the HMG box of LEF-1 for a series of 25 base pair (bp) oligonucleotides containing a central GG sequence, free or site-specifically modified by cisplatin, and to compare it to the affinity for a 25 bp oligonucleotide containing the recognition 9 bp motif. We have shown that cisplatin-GG adducts within double stranded DNA are weak but specific recognition targets for the HMG domain of LEF-1 to which the factor binds with 3 to 6 times larger affinity compared with the corresponding unplatinated sequence. The nature of the bases flanking the GG site has a significant influence on both the relative affinity and the enhancement due to platination. The binding of LEF-1 to all GG-cisplatin adducts was about one order of magnitude weaker than that to the native recognition sequence. Thus, the cisplatin-caused bending of DNA does produce a target for LEF-1 binding, however, the cisplatinated DNA does not appear to be a strong competitor for the LEF-1 recognition sequence. In the second part of the thesis, Deoxyribonuclease I (DNase I) footprinting methodology was used to analyze oligodeoxyribonucleotide duplexes containing a unique and single, site-specific adduct of the trinuclear bifunctional platinum compound BBR3464, and the results were compared with DNase I footprints of adducts of cisplatin. It was shown that various structural perturbations induced by platinum binding in the major groove propagated into the minor groove, allowing their detection by DNase I probing. The results also demonstrate the very high sensitivity of DNase I to DNA conformational alterations induced by platinum complexes so that the platinum adducts which induce specific local conformational alterations in DNA are differently recognized by DNase I. In the third part, we tested the possibility of involvement of ternary DNA-platinum-protein complexes in the mechanism of action of cisplatin. We compared the formation of cross-links between DNA and several proteins by cisplatin and by inactive trans-isomer, transplatin. The results indicate that the antitumor drug cisplatin is considerably more efficient in DNA-protein cross-linking than transplatin. Moreover, DNA-protein cross-links were shown to inhibit DNA polymerization by DNA polymerase RT-HIV-1, and their removal by NER was less efficient than that of DNA intrastrand CLs. The different propensity to form DNA-protein CLs distinguishing cisplatin and transplatin may be relevant to the different biological properties including antitumor activity of these two platinum complexes. In the last part of the thesis, we examined the stability of 1,2-GG-intrastrand CLs within the decamer duplex d(GCCG*G*GTCGC)-d(GCGACCCGGC) and the telomeric sequence (TTAGGG)4 containing four forms of three adjacent guanines. We have shown that cisplatin CLs formed at the GGG sequence were unstable and evolved with half-life times of tens of days in our experimental conditions. Apparently the 1,2-GG and 2,3-GG adducts are in slow exchange and evolve towards a majority of the 2,3-GG crosslink (decamer duplex), an approximately 1:1 mixture of 1,2-GG and 2,3-GG cross-l

Abstract:

inks (the 3-terminal GGG group of the telomeric repeat), or a majority of the 1,2-GG cross-link (three other GGG groups of the telomeric sequence). The relative stability of the 1,2-GG and 2,3-GG adducts seems thus to depend on the sequence context surrounding the GGG site.

Keywords

cisplatin, transplatin, BBR3464, Lymphoid enhancer factor 1, HMG-domain proteins, Deoxyribonuclease I, DNA-Pt-protein cross-links

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 12. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 12. 2006
• Vedoucí: prof. RNDr. Viktor Brabec, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Fyzika / Biofyzika