Zpětná rekonstituce nukleozomu po transkripci

Bc. Aneta Fišerová

Bachelor's thesis

Nucleosome reassembly after transcription

Abstract:

Nukleozomy jsou základní strukturní podjednotky eukaryotického chromatinu, které se skládají z komplexů malých bazických proteinů (histonů) a DNA. Tyto komplexy tvoří oktamer obalený 147 páry bazí. Nukleozomy představují bariéru transkripčního aparátu, a z tohoto důvodu je nutné, aby před průchodem polymeráz došlo alespoň k částečnému rozvolnění a následně ke zpětné rekonstituci po přepisu genetické informace. Tyto procesy jsou důležité pro zachování strukturní a regulační funkce chromatinu a usnadňují je histonové chaperony dosud neznámým mechanismem. Tato bakalářská práce směřovala k pochopení tohoto mechanismu, byla tak zaměřena na purifikaci klíčových proteinů (histonů a histonového chaperonu Spt6) se specifickými protokoly, přípravu DNA a další práci se všemi komponenty. Došlo k úspěšné purifikaci Spt6 a po zvolení alternativní cesty také k přípravě Widom 601 DNA sekvence. Dle výsledků z hmotnostní spektrometrie byly úspěšně purifikovány i histony – kopurifikací v párech, a to bez jakýchkoli zbytků histidinové kotvy. Z histonů byl sestaven oktamer ve správném molárním poměru 1:1:1:1, který byl použit pro rekonstituci nukleozomu. Na tuto práci bude následně navazovat strukturní studie se snahou pochopit mechanismus, jakým chaperon Spt6 asistuje v opětovném sestavení nukleozomu.

Abstract:

Nucleosome are the basic structure subunit of eukaryotic chromatin, it’s composed of complexes of small basic proteins (histones) and DNA, these complexes are formed by eight histone molecules wrapped by 147 base pairs. Nucleosomes represent a barrier to the transcription apparatus, and for this reason have to be at least partialy disassembled to facilitate the binding of polymerases and reassembled after polymerases pass. This is required to preserve the structural and regulatory functions of chromatin and are facilitated by histone chaperones by a mechanism that has not yet been described. This bachelor thesis was directed towards understanding this mechanism, thus focusing on purification of key proteins (histones and histone chaperone Spt6) with specific protocols, DNA preparation and further work with all components. Spt6 was successfully purified and, after selecting an alternative route, the Widom 601 DNA sequence was prepared. According to the results of mass spectrometry, histones were successfully purified - by co-purification in pairs, without any residual histidine anchor. An octamer was assembled from the histones in the correct molar ratio of 1: 1: 1: 1, which was used for nucleosome reconstruction. This work will be followed by a structural study focused on understanding of the mechanism by which the Spt6 chaperone assists in nucleosome reassembly.

Keywords

DNA, nukleozom, histon, Spt6, chromatin, histonový chaperon

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 17. 6. 2022
• Supervisor: prof. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.
• Reader: Mgr. Alena Hofrová

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry