Vývoj metody pro terapeutické monitorování vybraných benzodiazepinů metodou kapalinové chromatografie

Kateřina KRÁTKÁ

Bachelor's thesis

Development of the method for therapeutic drug monitoring of selected benzodiazepines by liquid chromatography

Abstract:

Úkolem bylo vyvinout, validovat a zavést do praktického použití metodu pro stanovení alprazolamu, bromazepamu, diazepamu, nordiazepamu, klobazamu, norklobazamu a klonazepamu. Vývoj metody probíhal na různých vysokoúčinných a ultra-vysokoúčinných kapalinových chromatografech za použití dvou typů detekcí (spektrofotometrické a hmotnostní). Během vývoje metody byly testovány různé druhy kolon, mobilní fáze (pH, aditiva), izokratické a gradientové eluce. Dokončení vývoje a následná validace metody probíhala na kapalinovém chromatografu Acquity UPLC ve spojení s hmotnostním detektorem od společnosti Waters. Separace probíhala na koloně Acquity UPLC BEH C18 50x2,1 mm o velikosti částic 1,7 ?m. Doba analýzy při gradientové eluci byla 11 minut. K ionizaci vzorků byl použit elektrosprej v pozitivním modu. Velkou výhodou bylo, že pro analyty byla dodržena úprava vzorku, typ kolony a složení mobilní fáze, které se na pracovišti používá. Linearita byla ověřena kalibrační křivkou. Hodnoty korelačních koeficientů byly u všech benzodiazepinů v rozsahu koncentrací v séru od 1 do 1000 ng/ml (pro klobazam 5,0-1000 ng/m) větší než 0,97.Pro hodnocení preciznosti a přesnosti byla měřena opakovatelnost a mezilehlá preciznost. Opakovatelnost byla měřena na 4 koncentračních hladinách a mezilehlá preciznost na 3 hladinách. Variační koeficienty všech analyzovaných látek se pohybovaly v rozmezí 0,10 - 7,86 % a výtěžnost metody se pohybovala mezi 97,5 - 109,60 %.

Abstract:

The topic of the bachelor thesis was to expand existing method for the determination of clonazepam, diazepam and nordiazepam in human serum of the department of Clinical Pharmacology at the University Hospital Ostrava with new benzodiazepines by liquid chromatography. This thesis is focused on the development of the method, validate and implement to practical use for quantification of alprazolam, bromazepam, diazepam, nordiazepam, clobazam, norclobazam and clonazepam. During the method, development was tested three liquid chromatography systems using two types of detection (spectrophotometry and mass spectrometry). For liquid chromatography analysis was used different types of columns, various compositions of mobile phases (pH, additives), isocratic and gradient elution were also tested. New developed method was validated by Acquity UPLC liquid chromatography system in combination with mass spectrometry detection (qDA, Waters system). Separation was performed using Acquity UPLC BEH C18 column 50x2,1 mm, with particle size 1,7 ?m. The time of chromatographic analysis was 11 minutes and used gradient of elution. Electrospray in positive mode was chosen as ionization mode. The great advantage of the method was the sample preparation step, the type of column and composition of the mobile phases was the same as in previously developed methods of the department of Clinical Pharmacology at the University Hospital Ostrava. Calibration curves were made for each compound for the concentration range of 1-1000 ng/ml (5-1000 ng/ml for norclobazam), and good linearity was observed for all analytes (r > 0,97). For evaluation of repeatability and intermediate precision of the method was measured precision and accuracy. Repeatablitiy was measured at 4 concentration levels and intermediate precision at 3 levels. Coeficient of variation was for all substances in the range from 0,10 to 7,86 % and recovery of the method was between 97,5 and 109,6 %.

Keywords

Benzodiazepiny, terapeutické monitorování léčiv, sérum, kapalinová chromatografie, UV/VIS detekce, hmotnostní spektrometrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 29. 4. 2021

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 8. 6. 2021
• Supervisor: Mgr. Pavel Šištík, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Medicine

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Laboratory Assistant