Vývoj metody relativní kvantifikace mRNA genu HMOX1 v různých tkáních prasete domácího s využitím termocykleru LightCycler® Nano (Roche)

Bc. Denisa Lehnerová

Master's thesis

Development of a method for relative quantification of HMOX1 gene mRNA in various tissues of domestic pig using LightCycler® Nano (Roche) thermocycler

Abstract:

Diplomová práce na téma "Vývoj metody relativní kvantifikace mRNA genu HMOX1 v různých tkáních prasete domácího s využitím termocykleru LightCycler® Nano (Roche)" se skládá ze dvou hlavních částí. Literární rešerší a experimentální částí, která byla provedena na Katedře genetiky a šlechtění ve spolupráci s Katedrou veterinárních disciplín na Fakultě agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů, Česká zemědělská univerzita v Praze.Literární rešerše se zabývá popisem genu HMOX1, jeho strukturou a regulací a dále je zde popsán produkt tohoto genu, protein hem oxygenáza, která je detailně popsána z hlediska její struktury a funkce. Z literární rešerše vyplývá, že gen HMOX1 a hem oxygenáza hrají mnoho důležitých rolí v těle. Mezi hlavní patří degradace hemu, jehož produkty (oxid uhelnatý, železo, biliverdin) mají své další funkce.Je zde vytvořen souhrn metod, které zkoumají expresi genů a hodnotí ji. Existuje mnoho takových metod, ale v této diplomové práci jsou popsány jen ty, které jsou nejznámější anebo používané v experimentální části této práce. Experimentální část je zaměřena na optimalizaci vybrané metody při použití přístroje LightCycler® Nano od firmy Roche. Začíná izolací totální RNA, přepisem RNA pomocí reverzní transkriptázy na cDNA a bioinformatickou analýzou primerů, které byly následně použity při samotné qRT-PCR. Pro analýzu a získání hodnot Ratio ∆Cq byl použit housekeepingový gen pro ribozomální protein L4.Z výsledků vyplývá, že gen HMOX1 se exprimoval v různých mírách ve všech získaných tkáních a nejvyšší expresi vykazovala slezina. Zde probíhá rozklad hemu, ke kterému je nutný enzym hem oxygenáza, produkt genu HMOX1. Byla detekována mRNA genu HMOX1 ve dvou vzorcích oocytů, které obsahovaly různý počet buněk. Bylo zjištěno, že mezi plemenem Duroc a Bílé ušlechtilé existuje rozdíl v pozici nasedání navrženého reversového primeru HMOX1 D, kde byl objeven SNP. Také bylo potvrzeno, že transkript genu HMOX1-202 získaný z databáze Ensembl je správný ve srovnání s transkriptem HMOX1-201, kterému chybí prodloužená 5’UTR oblast. Přítomnost této oblasti v transriptu genu byl potvrzen použitím primerů vložených do této oblasti a jejich specifickou amplifikací.Navržená metoda a použité postupy byly vhodné a dostatečně citlivé k detekci nízkých koncentrací cDNA ve vzorcích, a tak může být vytvořený protokol použit pro další genetický výzkum.Řešení diplomové práce bylo podpořeno projekty GA FAPPZ Studium geneticky podmíněných vlastností s využitím molekulárně – genetických, bioinformatických a statistických metod (SV20-9-21360) a Molekulární analýza nukleových kyselin rostlin a živočichů a možnosti jejího hodnocení s využitím metod bioinformatiky a biostatistiky (SV19-07-21360).

Abstract:

The diploma thesis named "Development of a method for relative quantification of HMOX1 gene mRNA in various tissues of domestic pig using the LightCycler® Nano (Roche) thermocycler" consists of two main parts. Literary research and experimental part, which was performed at the Department of Genetics and Breeding in cooperation with the Department of Veterinary Disciplines on Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Czech University of Life Sciences in Prague.The literature research deals with the description of the HMOX1 gene, its structure and regulation, and also describes in detail the product of this gene, protein heme oxygenase, which is described in detail in terms of its structure and function. The literature research shows, that the HMOX1 gene and heme oxygenase play many important roles in the body. The main ones include the degradation of heme, whose products (carbon monoxide, iron, biliverdin) have their other functions. There is a summary of methods, that examine gene expression and evaluate it. There are many such methods, but only those, that are best known or used in the experimental part of this thesis are described in this diploma thesis. The experimental part is focused on the optimization of the selected method using the LightCycler® Nano device from Roche. It begins with the isolation of total RNA, the transcription of RNA by reverse transcriptase into cDNA, and the bioinformatics analysis of primers, which were subsequently used in qRT-PCR alone. The housekeeping gene for the L4 ribosomal protein was used to analyze and obtain Ratio ∆Cq values. The results show that the HMOX1 gene was expressed to varying degrees in all tissues obtained, and the spleen showed the highest expression, where the heme, which requires the enzyme heme oxygenase, the product of the HMOX1 gene, is degraded. mRNA of HMOX1 gene was detected in two oocyte samples containing different numbers of cells. It was found that between the Duroc and White Noble breeds there is a difference in the annealing position of the proposed reverse primer HMOX1 D, where the SNP was discovered. It was also confirmed that the HMOX1-202 gene transcript obtained from the Ensembl database is correct compared to the HMOX1-201 transcript, which lacks the extended 5 'UTR region. The presence of this region in the gene transcript was confirmed using primers inserted into this region and their specific amplification. The proposed method and procedures used were suitable and sufficiently sensitive to detect low concentrations of cDNA in samples, so that the established protocol can be used for further genetic research.The solution of the diploma thesis was supported by projects GA FAPPZ Study of genetics conditions using molecular genetic, bioinformatics and statistical methods (SV20-9-21360) and Molecular analysis of nucleic acids of plants and animals and the possibility of its evaluation using methods of bioinformatics and biostatistics (SV19-07-21360).

Keywords

gen HMOX1, hem oxygenáza, PCR, qRT-PCR, exprese genu, Sus scrofa domestica

Keywords

HMOX1 gene, heme oxygenase, gene expression, PCR, qRT-PCR, Sus scrofa

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl
• Reader: Michaela Přibáňová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology