Nové analytické platformy pro diagnostiku dědičných metabolických poruch a jejich aplikace v klinické praxi

Mgr. Eliška IVANOVOVÁ

Doctoral thesis

New Analytical Platforms for the Diagnosis of Inherited Metabolic Disorders and their Application in Clinical Practice

Abstract:

Diagnostika dědičných metabolických poruch (DMP) vyžaduje komplexní hodnocení napříč různými obory, které zahrnuje klinické posouzení stavu pacienta lékařem, biochemické a zobrazovací vyšetření, stanovení enzymové aktivity či genetické testování. Včasná diagnosa a zahájení vhodné léčby jsou klíčovými faktory pro dobrou prognosu onemocnění. Laboratorní diagnostika založená na analýze specifických metabolitů je součástí diferenciální diagnostiky těchto onemocnění. Pro dosažení detailního přehledu o metabolickém profilu je nepostradatelné analyzovat co nejširší spektrum diagnosticky významných biomarkerů. Nejen z tohoto důvodu se v laboratořích v poslední době uplatňují pokročilé analytické techniky, mezi něž se řadí také kapalinová chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Pro svou univerzálnost, robustnost, citlivost a rychlost odpovídá požadavkům urgentní medicíny. V této práci jsou popsány dvě nové analytické platformy pro diagnostiku DMP, které byly otestovány a úspěšně zavedeny do klinické praxe v Laboratoři dědičných metabolických poruch, Oddělení klinické biochemie Fakultní nemocnice Olomouc. První platforma je založená na hydrofilní interakční chromatografii ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií, která byla primárně vyvinuta za účelem stanovení purinů a pyrimidinů. V průběhu rutinní praxe byla metoda rozšířena o další diagnosticky významné analyty (celkem 65), jako jsou vybrané acetylované aminokyseliny, acylglyciny, cukry a další. Jedná se tak o metodu, která je jedinečná v pokrytí široké škály metabolitů. Součástí přístupu je jednoduchý diagnostický pracovní postup, jehož cílem bylo dosáhnout snadného vyhodnocení a interpretace komplexních dat. V druhé části práce je popsána nová rychlá a účinná LC-MS/MS metoda pro stanovení vybraných organických kyselin a acylkarnitinů ve vzorcích suchých krevních skvrn (DBS). Tato metoda je aplikována jako druhostupňová u vzorků DBS, u nichž byl pozorován abnormální nález v koncentraci C3-, C4- nebo C5-karnitinů v rámci novorozeneckého a selektivního screeningu DMP, které jsou prováděny metodou přímého nástřiku. Aplikace nových analytických platforem do rutinního provozu laboratoře přinesla zjednodušení, zrychlení a zefektivnění diagnostiky vybraných DMP.

Abstract:

Diagnosis of inherited metabolic disorders (IMD) requires a comprehensive evaluation across multiple disciplines, including a clinical assessment of the patient's condition by a physician, biochemical and imaging testing, enzyme activity assays, and genetic testing. Early diagnosis and initiation of appropriate treatment are key factors for a good prognosis of the disease. Laboratory diagnosis based on the analysis of specific metabolites is a part of the differential diagnosis of these disorders. To achieve a detailed overview of the metabolic profile, it is essential to analyse as wide a spectrum of diagnostically relevant biomarkers as possible. Not only for this reason, advanced analytical techniques have recently been applied in laboratories, including liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Due to its versatility, robustness, sensitivity and rapidness, it meets the requirements of emergency medicine. This thesis presents two new analytical platforms for the diagnosis of IMD which have been tested and successfully introduced into clinical practice in the Laboratory of Inherited Metabolic Disorders, Department of Clinical Biochemistry, Olomouc University Hospital. The first platform is based on hydrophilic interaction chromatography with tandem mass spectrometry, which was primarily developed for the determination of purines and pyrimidines. During the routine practice, the method has been extended to other diagnostically important analytes (65 in total), such as selected acetylated amino acids, acylglycines, sugars and others. Therefore, it is a method that is unique in its coverage of a wide range of metabolites. The approach includes a simple diagnostic workflow that was designed to achieve easy evaluation and interpretation of complex data. In the second part of the paper, a new rapid and efficient LC-MS/MS method for the determination of selected organic acids and acylcarnitines in samples of dried blood spots (DBS) is described. The method is applied as a second-tier to DBS samples in which abnormal findings in C3-, C4- or C5-carnitines levels have been observed in the context of newborn and selective screening of IMD performed by direct injection. The application of the new analytical platforms to routine practice of the laboratory simplified, speeded and streamlined the diagnosis of selected IMD.

Keywords

dědičné metabolické poruchy, diagnostika, hmotnostní spektrometrie, kapalinová chromatografie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 6. 2024

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. David Friedecký, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Genetics / Medical Genetics