Príprava dvojrozmerných polyakrylamidových gélov z proteínových extraktov koreňov Lucerny siatej

Jakub PETROVAJ

Bachelor's thesis

Preparation of two-dimensional polyacrylamide gels from Medicago sativa root protein extracts

Abstract:

Proteomika je disciplína zaoberajúca sa analýzou kompletného proteínového zloženia biologického materiálu. Dvojrozmerná elektroforéza je v proteomike bežne používanou separačnou metódou, často využívanou aj na detekciu fosforylácie. Dôležitým predpokladom úspešnej separácie bielkovín pomocou dvojrozmernej elektroforézy je extrakcia. V predloženej bakalárskej práci sme sa zaoberali optimalizáciou extrakčného protokolu pre proteíny z koreňových pletív lucerny siatej. Optimalizovaním obsahu proteínov a prípravou čerstvého farbiva sa docielilo detekcie pomerne vysokého počtu škvŕn. Zistili sme tiež, že už 30 minútové ovplyvnenie rastlín lucerny peroxidom vodíka vyvoláva značné kvalitatívne a kvantitatívne zmeny v proteínových škvrnách na dvojrozmerných géloch. Stresom indukovaná mitogénom aktivovaná proteínkináza (SIMK) je kináza dôležitá pre rôzne stresové odpovede lucerny. Kombináciou dvojrozmernej elektroforézy a imunoblotovania s použitím primárnej protilátky rozpoznávajúcej blízky heterológ SIMK u Arabidopsis, MPK6, sme detegovali spolu 6 škvŕn s molekulovou hmotnosťou zhodnou so SIMK. Špecificita týchto škvŕn musí byť experimentálne testovaná. Použitím jednorozmernej elektroforézy a imunoblotovania sme zistili, že SIMK nemení výrazne svoju abundanciu v odpovedi na 30 minútové pôsobenie peroxidu vodíka. Detekcia fosforylácie SIMK pomocou fosfošpecifickej protilátky však ukázala výraznú fosforyláciu. Výsledky naznačujú, že SIMK môže byť v rastlinách lucerny zapojená do signalizácie oxidatívneho stresu, napríklad pri soľnom strese alebo imúnnej odpovedi.

Abstract:

Proteomics is a powerful method involved in identification of a protein composition of complex biological samples. Two-dimensional electrophoresis is a common separation technique used in proteomics, which is often exploited also to identify protein phosphorylation. Proper protein separation on twodimensional gels is preconditioned by efficient extraction. Within this thesis we aimed to optimize the protein extraction from root tissues of alfalfa. We have found, that 100?g protein load and usage of fresh staining solution appeared as important determinators of the gel quality. We have also found that a 30 minutes long hydrogen peroxide treatment lead to significant qualitative and quantitative changes in two-dimensional gel spot patterns. A stress induced mitogen activated protein kinase (SIMK) is a kinase important for induction of multiple stress responses in alfalfa. According to our results, SIMK is phosphorylated in response to hydrogen peroxide (as found by immunoblotting using phosphospecific antibody), while its abundance does not substantiately change. Combining two-dimensional electrophoresis with imunoblotting (using primary antibody recognizing a close heterologue of SIMK in Arabidopsis called MPK6) did not show obvious differences betrween control and hydrogen peroxide treatment. In conclusion, our results show that SIMK may be involved in oxidative stress signalling in alfalfa, likely induced by salt stress or immune response.

Keywords

Dvojrozmerná elektroforéza, SIMK, imunoblotovanie, oxidatívny stres, fosforylácia, proteomika

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 5. 2019

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Tomáš Takáč, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering