Screening a charakterizace zdokonalených trombolytik

Mgr. Martin Toul

Advanced ('rigorózní') thesis

Screening and Characterization of Improved Thrombolytics

Abstract:

Alteplasa, aktuálně používané trombolytikum pro rozpouštění krevních sraženin při ischemické cévní mozkové příhodě, vykazuje celou řadu vedlejších účinků a nedostatečnou efektivitu. O tom svědčí i více než 6 milionů úmrtí na mrtvici ročně a taky to, že mozková příhoda je hlavní příčinou neurologické invalidity. I přesto zůstává alteplasa od roku 1996 stále jediným schváleným léčivem, z čehož plyne absolutní nezbytnost věnovat se výzkumu nových terapeutických přístupů včetně vývoje vylepšených trombolytických léčiv. Tato rigorózní práce shrnuje principy a aktuální stav léčby mozkové mrtvice, porovnává současná trombolytická terapeutika a poskytuje přehled strategií pro jejich další zdokonalení, ale taktéž přehled laboratorních metod pro jejich testování. Teoretické poznatky byly rozšířeny o experimentální optimalizaci a vývoj robustních biochemických esejí pro spolehlivé a časově nenáročné měření a identifikaci trombolytických proteinů s modifikacemi klíčových vlastností. Vyvinuté eseje byly následně aplikovány na nová kandidátní trombolytika navržená výpočetními metodami. Testování odhalilo atraktivní mutantní variantu alteplasy, která vykázala 1000× zlepšenou selektivitu vůči fibrinu, 4× zesílenou rezistenci vůči inhibitoru a 4× zvýšený potenciál penetrace do krevních sraženin. Výsledky tak naznačily prodloužený biologický poločas v krevní plazmě a minimalizované vedlejší účinky v podobě krvácení, které jsou hlavními nedostatky současné trombolytické léčby. Tato vylepšení byla reálně potvrzena stanovením hladin jednotlivých komponent a biomarkerů v plazmě po trombolytických experimentech in vivo v potkaních zvířecích modelech. Nově vyvinutá modifikovaná varianta alteplasy má významný terapeutický potenciál stát se bezpečnějším a efektivnějším trombolytickým léčivem se zachovanou aktivitou.

Abstract:

Since its initial approval in 1996, alteplase is still the only thrombolytic drug used to treat acute ischemic stroke. However, its efficiency is far from ideal, as evidenced by more than 6 million stroke-related deaths every year and by stroke being the top leading cause of neurological disability. Therefore, it is critical to develop new treatment possibilities, including improved thrombolytic drugs. This thesis summarizes the principles and the current status of stroke treatment, compares existing thrombolytic therapeutics, and gives an overview of strategies for their further improvements as well as laboratory methods for their testing. The theoretical background was further extended with experimental optimization and the development of robust biochemical assays for reliable and time-effective screening of various key properties of thrombolytic drugs. The optimized assays were subsequently applied to a number of novel candidate thrombolytics designed by computational design. The testing identified an attractive mutant variant of alteplase with 1,000-fold fibrin selectivity, 4-fold increased inhibition resistance, and 4-fold enhanced clot penetrability potential. Such results indicated a prolonged half-life and minimized risk of bleeding side-effects which are the major drawbacks of the current thrombolytic treatment. These beneficial properties were further confirmed by analyzing levels of plasma components and biomarkers after in vivo thrombolysis experiments with rat animal models. Collectively, the data show that the newly developed modified variant of alteplase has a high therapeutic potential of becoming a safer and more efficient thrombolytic drug with retained activity.

Keywords

trombolytikum, alteplasa, desmoteplasa, proteinové inženýrství, léčivo, kardiovaskulární choroby, ischemická cévní mozková příhoda, thrombolytic, alteplase, desmoteplase, protein engineering, drug, cardiovascular diseases, ischemic stroke

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 10. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 19. 12. 2022
• Reader: doc. RNDr. Erik Sedlák, DrSc., Mgr. Jan Sýkora, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Advanced ('rigorózní řízení') programme / field:
Environment and Health / Environment and Health