Kvantitativní analýza interakcí lidských telomerových proteinů

Bc. Jana Pavloušková, Ph.D.

Master's thesis

Quantitative analysis of interactions of human telomeric proteins

Anotácia:

Telomery jsou nukleoproteinové struktury nacházející se na koncích chromozomů. Telomery chrání konce chromozomů před jejich rozpoznáním jako dvouřetězcových zlomů DNA vysoce citlivými opravnými mechanismy buňky. Prostorová struktura a tvar telomerové DNA je určována multiproteinovým komplexem nazývaným Shelterin. Shelterin se skládá ze šesti proteinů. Tři proteiny se přímo vážou na telomerickou DNA (TRF1, TRF2 a POT1) a jsou propojeny do plně funkčního komplexu třemi dalšími proteiny (TIN2, TPP1 a RAP1). Tato práce se zabývá studiem proteinu TIN2 a jeho vlivu na vazebnou afinitu proteinu TRF2 k telomerické DNA. Gen proteinu TIN2 byl klonován do několika bakteriálních vektorů z důvodu optimalizace jeho exprese. Protein TIN2 byl exprimován v E. coli a purifikován metaloafinitní chromatografií. Vliv proteinu TIN2 na vazebnou afinitu proteinu TRF2 k telomerické DNA byl určen za použití měření anizotropie fluorescence. Bylo zjištěno, že přítomnost proteinu TIN2 zvyšuje dvakrát vazebnou afinitu proteinu TRF2 k telomerické DNA. Bylo také zjištěno, že toto zvýšení vazebné afinity je silně závislé na pH a koncentraci soli v prostředí.

Abstract:

Telomeres are nucleoprotein structures at the ends of chromosomes. Telomeres protect chromosome ends from their unwanted recognition as double-strand DNA breaks by extremely sensitive reparative mechanisms of cell. The spatial structure and shape of telomeric DNA in controlled by a multiprotein complex called Shelterin. Shelterin is composed of six proteins. Three proteins bind directly to the telomeric DNA (TRF1, TRF2 and POT1) and they are interconnected into fully functional complex by three other proteins (TIN2, TPP1 and RAP1). This work has been focused on protein TIN2 and its influence on the DNA binding affinity of TRF2 protein. The gene of TIN2 was cloned into several bacterial vectors in order to optimize protein expression. The TIN2 protein was expressed in E. coli and purified using metal ion affinity chromatography. Then, the effect of TIN2 protein to the binding affinity of TRF2 protein to telomeric DNA was determined using fluorescence anisotropy measurements. It was shown that TIN2 increased 2 fold the binding affinity of TRF2 protein to telomeric DNA. It has also been shown that the increase in the binding affinity is strongly dependent on pH and salt concentration in the solution.

Keywords

DNA, interaction, protein, Shelterin, telomere

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 1. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 30. 1. 2012
• Vedúci: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Analytical Biochemistry