Changes in protein structure and their complex formation associated with degenerative diseases

Mgr. Alena Hofrová, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Karboanhydráza IX (CA IX), Tau protein a KIX doména představují strukturně a funkčně odlišné proteiny, které jsou spojovány s nádorovými a neurodegenerativními onemocněními. Tato disertační práce využívá především nukleární magnetickou rezonanci (NMR) ke strukturní charakterizaci a studiu interakčních vlastností karboanhydrázy IX, Tau proteinu a KIX domény. CA IX je membránově vázaný enzym, který hraje klíčovou roli v hypoxických nádorech prostřednictvím acidifikace extracelulárního prostředí, čímž podporuje nádorovou progresi. Ačkoli je CA IX považována za slibný terapeutický cíl, její inhibice musí být vysoce selektivní, aby nedošlo k ovlivnění dalších fyziologicky nezbytných izoenzymů z této rodiny. CA IX obsahuje vnitřně neuspořádaný region (IDR), který zvyšuje její katalytickou aktivitou, avšak jeho přesný mechanismus je dosud nedostatečně objasněn. Tato práce se zaměřila na optimalizaci přípravy CA IX a strukturální charakterizaci predikovaných lokálních struktur v oblasti IDR. Zároveň byla studována katalytická aktivita CA IX a její inhibice pomocí stopped-flow kinetiky se sérií nových sulfonamidových inhibitorů, které dosáhly efektnivní inhibice s nanomolárními hodnotami inhibičních konstant. Dále práce charakterizovala strukturální dynamiku a interakční profil vnitřně neuspořádaného proteinu Tau, který se podílí na neurodegenerativních onemocněních, jako je Alzheimerova choroba. Protein Tau byl studován ve fosforylovaném i nefosforylovaném stavu s následnými experimenty pro stadium vlivu fosforylace na na vazbtu Tau protein a 14-3-3ζ. Výsledky odhalily nový mechanismus vazby mezi proteinem Tau a 14-3-3ζ, včetně dříve neznámých stechiometrických poměrů mezi těmito dvěma proteiny. V neposlední řadě se práce zabývala konformační přizpůsobivostí KIX domény s cílem porozumět mechanismu transkripční regulace prostřednictvím interakce s konzervovaným transaktivačním devíti-aminokyselinovým motived (9aaTAD), který je sdílen mezi transkripčními faktory. Získané poznatky přispívají k hlubšímu porozumění strukturálních a funkčních vlastností klíčových proteinů spojených s degenerativními procesy a mohou sloužit jako základ pro vývoj cílených diagnostických a terapeutických strategií.

Abstract:

Carbonic anhydrase IX (CA IX), Tau protein, and the KIX domain represent structurally and functionally diverse proteins implicated in cancer and neurodegeneration. This thesis primarily employs nuclear magnetic resonance spectroscopy to investigate the structural and functional features of CA IX, Tau and KIX domain. CA IX is a membrane-bound enzyme that plays a key role in hypoxic tumors by acidifying the extracellular environment, thereby promoting tumor progression. Although CA IX is considered a promising therapeutic target, its inhibition must be highly selective to avoid affecting other physiologically essential isoenzymes of this family. CA IX contains an intrinsically disordered region (IDR) that enhances its catalytic activity; however, the precise mechanism behind this remains insufficiently understood. This work focused on optimizing the preparation of CA IX and structurally characterizing the predicted local structures within the IDR. Additionally, the catalytic activity of CA IX and its inhibition were studied using stopped-flow kinetics with a series of novel sulfonamide inhibitors, which achieved effective inhibition with nanomolar inhibition constants. Furthermore, this thesis characterized the structural dynamics and interaction profile of the intrinsically disordered Tau protein involved in neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease. Tau protein was investigated in non-phosphorylated and phosphorylated forms, followed by experiments examining the effect of phosphorylation on the interaction with the 14-3-3ζ protein. The results proposed a new binding mechanism between Tau protein and 14-3-3ζ with previously unknown stoichiometry ratios between both proteins. Lastly, the thesis explored the conformational adaptability of the KIX domain to understand the mechanism of transcription regulation through the interaction with the established nine-amino-acid transactivation domain motif (9aaTAD) shared among transcription factors. The obtained findings contribute to a deeper understanding of the structural and functional properties of key proteins involved in degenerative processes and may serve as a foundation for the development of targeted diagnostic and therapeutic strategies.

Keywords

karboanhydráza IX (CA IX), CA II, Tau protein, KIX doména, c-Myb, MLL, p53, 9aaTAD, nukleární magnetická resonance, NMR, Tau, stopped-flow kinetika 13-3-3, 14-3-3Ϛ, stopped-flow kinetika

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 7. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 7. 2025
• Vedoucí: doc. RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Oponent: prof. Mgr. Daniel Jancura, PhD., Assoc. Prof. Dennis Kurzbach

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biomolekulární chemie a bioinformatika / Biomolekulární chemie a bioinformatika