Elektrochemické ELISA metody

Bc. Daniel Dobrovodský

Diplomová práce

Electrochemical Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Methods

Anotace:

Tato diplomová práce se věnuje vývoji elektrochemické ELISA (z angl. Enzyme-linked immunosorbent assay) metody stanovení nádorového supresoru proteinu p53 využitím mikroskopických magnetických částic a voltametrické detekce na tištěných uhlíkových elektrodách (SPCE). Protein p53 je klíčový v prevenci rakoviny. Jeho mutované formy, nalézající se téměř u 50-ti % všech lidských typů nádorů, mohou být použity jako diagnostické markery jejich zhoubnosti. Proto je vývoji rychlé, jednoduché a citlivé metody jeho detekce věnována značná pozornost. Pro tyto účely byly v naší laboratoři připraveny SPCE, které byly elektrochemicky charakterizovány a jejich příprava optimalizována pomocí cyklické voltametrie a reverzibilního redoxního systému K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]. Optimalizovány byly také parametry sendvičové ELISA metody (koncentrace činidel/protilátek, pufrů i inkubační doby), která využívala primární protilátku DO-1 zachycenou na magnetických kuličkách, studovaný protein p53, biotinilovanou detekční protilátku Bp53-10 a streptavidinem značenou alkalickou fosfatázu přeměňující naftyl fosfát na elektrochemicky aktivní 1-naftol. Takto získaný 1-naftol byl stanoven s limitem detekce 0,7 ng ml−1 pomocí voltametrie s lineárním skenem na dispozabilních SPCE. Tento systém je srovnatelný s běžně používanou ELISA metodou využívající spektrofotometrickou detekci 4-nitrofenolu s limitem detekce 0.3 ng ml−1. Použitím magnetických kuliček s vázanou primární protilátkou bylo dosaženo vyšší reakční účinnosti a tak zredukován čas potřebný pro tento postup z 360 min, potřebných pro běžnou ELISA metodu, na 60 min. Vyvinutá metoda byla úspěšně použita pro detekci p53 v různých buněčných lyzátech v přítomnosti vybraných koncentrací modelových cytostatik (doxorubicin, fluoruracil and cis-platina) a tetracyklinu. Tato metoda dostatečně koreluje s běžně používanými komerčními ELISA a western blot metodami, což potvrzuje její spolehlivost jako alternatívní a perspektivní techniky detekce p53.

Abstract:

This thesis concerns with development of an electrochemical enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for determination of tumour suppressor protein p53 based on microscopic magnetic beads (MB) and voltammetric detection at screenprinted carbon electrodes (SPCE). Protein p53 is crucial in cancer prevention. Its mutated forms, found in almost 50% of human tumour types, can be used as diagnostic markers for malignancy. Consequently, development of a fast, simple and sensitive method for its detection is of high interest. Homemade disposable SPCE were electrochemically characterised and their construction was optimised by cyclic voltammetry and reversible redox system of K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6]. Parameters (reagent concentrations, buffers and incubation times) of the sandwich ELISA system composed of MB with immobilised capture antibody DO-1, studied p53, biotinylated detection antibody Bp53-10 and streptavidin labelled alkaline phosphatase converting naphthyl phosphate to electrochemically active 1-naphtol were optimised. Produced 1-naphthol was determined by linear sweep voltammetry at disposable SPCE with limit of detection 0.7 ng ml-1. This system was compared with conventional ELISA based on spectroscopic detection of 4-nitrophenol with limit of detection 0.3 ng ml-1. Utilisation of MB with immobilised specific capture antibody provided increased reaction efficiency and reduction of time for the assay from 360 min required for conventional ELISA to 60 min. The developed method was successfully applied for detection of p53 in different cell lysates with various levels of its expression induced by selected model cytostatics (doxorubicin, fluorouracil, cisplatin) or tetracycline. The developed method accurately correlates with conventional ELISA and western blot, proving its reliability as an alternative and perspective p53 detection technique.

Keywords

ELISA, p53, Tištené uhlíkové elektrody, Magnetické kuličky, Voltametrie, Elektrochemie, Screen-printed carbon electrodes, Magnetic beads, Voltammetry, Electrochemistry

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 6. 2018
• Vedoucí: RNDr. Aleš Daňhel, Ph.D.
• Oponent: doc. RNDr. Vlastimil Vyskočil, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biomolekulární chemie