Charakterizace funkčních domén nekanonické poly(A) polymerázy

Bc. Ivana Horváthová

Master's thesis

Characterization of functional domains in a noncanonical poly(A) polymerase

Abstract:

Osud RNA molekul v buňce může být ovlivněn modifikací jejich 3'-konce. Taková změna týkající se přidání nekódovaných ribonukleotidů je úlohou specifické rodiny enzymů nazvaných 3'-terminální nukleotidyl transferázy. V této skupině bylo popsáno sedm nekanonických poly(A) polymeráz. Patří sem i TUT4 (terminální uridylyl transferáza 4) mající schopnost připojit několik zbytků UTP k substrátovým molekulám RNA. Vzniklý poly(U) konec hraje důležitou roli v metabolismu RNA. Nejprve byl TUT4 protein identifikován jako negativní modulátor exprese cytokinů spouštěné transkripčním faktorem NF-κB. Nedávno se prokázala jeho role v regulaci exprese některých miRNA. V embryonálních kmenových a určitých rakovinových buňkách uridyluje TUT4 ve spolupráci s LIN28 prekurzorovou formu let-7 miRNA, následkem čehož je potlačeno její dozrání na posttranskripční úrovni. Tímto způsobem přispívá TUT4 k udržení pluripotentního stavu kmenových buněk a má také onkogenní vlastnost. TUT4 je navíc zahrnut v regulaci exprese interleukinu-6 (IL-6) tím, že uridyluje zralé formy miRNA zacílené na 3'UTR mRNA IL-6. Kromě miRNA uridyluje enzym TUT4 také histonovou mRNA, čímž zahajuje její degradaci na konci S fáze. Dále TUT4 podporuje buněčné dělení, a to nezávisle na uridylační aktivitě. V této práci jsme se zaměřili na určení minimální proteinové oblasti TUT4, která je nezbytná pro uridylační aktivitu. K prozkoumání proteinu jsme vytvořili několik zkrácených a bodově mutantních forem, abychom zjistili jejich potenciál pro přenos nukleotidů k 3'-konci molekul RNA pomocí biochemické eseje in vitro. Tímto jsme lokalizovali krátký fragment TUT4 stále schopný katalyzovat uridylaci in vitro. Naším dalším cílem bylo vymezit domény nepostradatelné pro protein-proteinovou interakci mezi TUT4 a LIN28. Ačkoli sestavení jejich komplexu je závislé na přítomnosti pre-let-7 miRNA, není stále objasněno, zda se tyto dva proteiny v komplexu váží vzájemně a která část TUT4 kontaktuje miRNA.

Abstract:

Fate of RNA molecules in a cell can be influenced by a modification at their 3'-end. Such an alteration concerning noncoded ribonucleotides addition is a task for specific enzyme family called 3’-terminal nucleotidyl transferases. Among these, seven mammalian noncanonical poly(A) polymerases have been described. One group member named TUT4 (terminal uridylyl transferase 4) possesses a function to attach several UTP residues to RNA substrates thereby forms a poly(U) tail. These stretches of uridine play an important role in RNA metabolism. TUT4 was initially identified as a negative modulator of NF-κB triggered cytokine expression. More recently, it was shown to regulate expression of several miRNAs. In embryonic stem cells and certain cancer cells, TUT4 in concert with LIN28 uridylates precursors of the let-7 miRNA, resulting in posttranscriptional repression of let-7 maturation. This way TUT4 contributes to maintain the pluripotent state of stem cells and has an oncogenic property. In addition, TUT4 is required to regulate interleukin-6 (IL-6) expression via uridylation of mature miRNA targeting 3'UTR of IL-6 mRNA. Apart from miRNAs, TUT4-mediated uridylation initiates histone mRNA degradation in the end of S-phase. Besides, TUT4 acts to promote cell cycle progression independently of its uridylyl transferase activity. In this work we aimed to determine the minimal protein region of TUT4 required for uridylation activity. To dissect the TUT4 protein, we generated several truncated and point mutant forms to reveal their potential to transfer nucleotides to 3’-end of RNA using biochemical assays in vitro. We have identified the minimal TUT4 region that is still able to catalyze uridylation in vitro. Our next goal was to map domains required for protein-protein interaction between TUT4 and LIN28. Although, their complex assembly is dependent on the presence of pre-let-7 miRNA, it is not clear whether these two proteins are physically connected to each other and what part of TUT4 contacts the miRNA.

Keywords

TUT4, poly(U) polymeráza, uridylace RNA, degradace RNA, LIN28, let-7 miRNA, poly(U) polymerase, RNA uridylation, RNA degradation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2012
• Supervisor: doc. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry