Analýza jaderných proteinů ječmene s využitím chemické modifikace cysteinu

Bc. Markéta BUDÍNSKÁ

Master's thesis

Anotácia:

Jaderné proteiny jsou životně důležitou součástí eukaryotických buněčných jader. Jsou zapojeny do procesů strukturální a funkční organizace, genové exprese a buněčného dělení. Jaderná proteomika představuje užitečný přístup pro studium mechanismů, které jsou základem odpovědi rostliny na abiotický stres, zahrnujících protein-proteinové interakce, enzymové aktivity a posttranslační modifikace. Rostlinný jaderný proteom však nebyl doposud dostatečně prozkoumán. Cílem této práce bylo otestovat metodu identifikace jaderných proteinů ječmene pomocí hmotnostní spektrometrie s využitím chemické modifikace cysteinu. Pro tento účel byla nejprve provedena optimalizace protokolu pro modifikaci cysteinu alkylačními činidly 2-bromethylaminem, 3-brompropylaminem a N-(jodethyl)-trifluoracetamidem. Na základě výsledků MALDI-TOF/TOF analýz byl odvozen optimální protokol modifikace, který byl následně použit v dalším experimentu při identifikaci proteinů z G1 a G2 jader ječmene. Proteiny alkylované 2-bromethylaminem byly separovány polyakrylamidovou gelovou elektroforézou v přítomnosti dodecylsíranu sodného a podrobeny trypsinovému štěpení. Vzniklé peptidy byly po separaci kapalinovou chromatografií identifikovány tandemovou hmotnostní spektrometrií ESI-MS/MS. Ve vzorku G1 jader bylo identifikováno celkem 252 proteinů, z nichž u 11 došlo k aminoethylaci cysteinu. Ve vzorku G2 jader bylo identifikováno celkem 442 proteinů, kdy byl aminoethylovaný cystein nalezen u 86 z těchto proteinů. V práci byla také potvrzena schopnost trypsinu štěpit v místě aminoethylovaného cysteinu.

Abstract:

Nuclear proteins are a vital component of eukaryotic cell nuclei. They are involved with structural and functional organization of nucleus, gene expression and cell division. Nuclear proteomics is a useful approach for studying the mechanisms underlying plant responses to abiotic stresses, including protein-protein interactions, enzyme activities, and post-translational modifications. However, the plant nuclear proteome has not been well explored. The aim of this work was to test the method of nuclear protein identification by mass spectrometry using chemical modification of cysteine. The protocol of the modification of cysteine with alkylating agents 2-bromethylamine, 3-brompropylamine and N-(jodoethyl)-trifluoracetamide was first optimized for this experiment. Based on the results of the MALDI-TOF/TOF analysis, the optimal protocol was derived, and this protocol was used in another experiment to identify proteins from G1- and G2-phase nuclei of barley. The alkylated proteins with 2-bromethylamine were separated by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis and digested with trypsin. The isolated peptides were separated by liquid chromatography and identified by tandem mass spectrometry ESI-MS/MS. There were 252 proteins identified in the sample from G1 phase nuclei, 11 of these proteins was aminoethylated. In the sample from G2-phase nuclei were 442 proteins identified and 86 from these proteins had aminoethylated cysteine in amino acid sequence. The ability of trypsin to cleave at the site of aminoethylated cysteine was confirmed in this work.

Kľúčové slová

modifikace cysteinu, aminoethylace, brdmethylamin, jaderné proteiny, hmotnostní spektrometrie

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 5. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / odbor:
Biochemistry / Biochemistry